ВІННИЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. М.І.Пирогова
кафедра загальної та біологічної хімії
Практикум
з біохімії
та методичні матеріали
для студентів ІІ курсу
Вінниця – 2009
11. ПЕРЕДМОВА
Практикум та методичні рекомендації складені у вiдповiдностi до
Програми з бiологiчної хiмії для студентiв фармфакультетів медичних вузiв.
Мiстять як традиційні так і новітні методи лабораторних досліджень
найважливіших хімічних компонентів організму. При підготовці до
практикуму та оформленні протоколів досліджень студенти мають приділити
основну увагу таким аспектам: принцип методу роботи, хід роботи, розрахунки
та висновки. Посібник призначений також для кращого засвоєння теоретичного
матеріалу, оскільки в кожному розділі наведені списки основної та додаткової
літератури, контрольні питання для підсумкового заняття.
В процесі самопідготовки студент може скористатися спеціальною
кімнатою на кафедрі, де до його послуг є навчальні таблиці, записи лекцій та
інші посібники. З незрозумілих питань студенту допомагає одержати
консультацію черговий викладач в день відробок.
2. Загальні відомості
2.1. Порядок проведення відробок лабораторно-практичних занять та
лекцій.
- Всі пропущені, або незараховані практичні заняття рекомендують
студентам відробити на протязі двох тижнів.
- Відробки проводяться один раз на тиждень, в суботу,(під час канікул -
щоденно) з 9 до 15 години згідно розкладу ( І, ІІ, ІІІ пара) черговими
викладачем та лаборантом. Студенту надається право відпрацювати за день три
заняття.
-Студент з’являється на відробку не пізніше 13 години, маючи на руках:
а) дозвіл з деканату,
б) посвідчення особи з фотокарткою,
в) зошит для протоколів практичних робіт.
- У випадку, коли студент бажає відпрацювати практичне заняття за
попередній семестр, він повинен записатися на відробку за два дні, оскільки
лаборантам необхідний час для приготування відповідних реактивів, посуду та
обладнання.
- Заняття вважається відпрацьованим, якщо під час відробки виявлено,
що студент:
а) володіє теоретичним матеріалом з теми заняття,
б) знає принцип методу та хід роботи,
в) задовільно виконав практикум.
Якщо практична робота не виконана під час відробки, і не підписаний
протокол з виконаних практичних робіт, то таке заняття вважається не
відпрацьованим.
- Факт відробки фіксується за підписом викладача та лаборанта в трьох
документах:
а) кафедральному журналі відробок,
2б) протоколі практичних робіт,
в) на зворотній стороні "дозволу".
- Відробку самостійних, підсумкових робіт та пропущених лекцій
проводить викладач групи під час проведення занять.
2.2. Техніка безпеки при роботі в хімічній лабораторії та надання
першої допомоги.
1. Під час роботи в хімічній лабораторії необхідно дотримуватись чистоти,
тиші, порядку та правил техніки безпеки.
2. Кожний працюючий повинен знати, де знаходяться в лабораторії засоби
протипожежного захисту та аптечка.
3. Категорично забороняється палити, приймати їжу, пити воду в
лабораторії.
4. Не можна приступати до роботи, доки працюючий не засвоїть принцип
та хід її виконання.
5. Досліди потрібно проводити тільки в чистому посуді. Не можна
користуватись реактивами з не підписаних склянок. Після закінчення
роботи посуд відразу вимити.
6. В процесі роботи необхідно слідкувати, щоб речовини не потрапляли на
шкіру обличчя та рук, особливо в очі.
7. Ніяких речовин в лабораторії не коштувати на смак, нюхати речовини
можна лише обережно, направляючи на себе пари або гази, легкими
рухами руки.
8. На всіх банках та іншому посуді, де зберігаються реактиви, повинні бути
назви реактивів.
9. Під час нагрівання рідких та твердих речовин в пробірках та колбах
забороняється направляти їх отвір на себе або сусіда.
10. Після закінчення роботи необхідно вимкнути газ, воду, напругу.
11. Забороняється виливати в раковину концентровані розчини кислот та
лугів.
12. При роботі з отруйними речовинами, кислотами та лугами, фенолом та
ін., необхідно користуватись захисними окулярами, протигазами та
респіраторами.
13. Досліди з легкозапальними речовинами проводити якомога далі від
полум’я та електроприладів.
14. При виникненні пожежі негайно відключити газ та електроприлади у
всій кімнаті. Полум'я загасити вогнегасником, піском або використати
протипожежну ковдру.
15. Якщо на комусь займеться одяг, необхідно потерпілого покласти на
підлогу та накрити ковдрою.
16. При термічних опіках терміново роблять примочки спиртовим
розчином таніну, етиловим спиртом або розчином КМnО4.
17. При опіках їдкими лугами добре промити уражене місце проточною
водою, потім 3% розчином борної кислоти.
318. При попаданні кислоти на шкіру потрібно зразу ж добре промити водою
на протязі 3-5 хв., потім промити розчином натрій гідрокарбонату.
19. При попаданні їдких речовин в очі, необхідно швидко промити очі
великою кількістю води або іншого нейтрального розчинника, потім
потерпілого доставити в медпункт.
20. З метою запобігання інфікування студентів СНІД’ом, гепатитом чи
венеричними захворюваннями, забір крові у студентів для визначення
тих чи інших біохімічних показників не проводиться. Всі біохімічні
показники визначаються на практичному занятті тільки в штучній
сироватці крові або в донорській крові, взятій на станції переливання
крові.
2.3. Список основної літератури, якою рекомендовано користуватись
студентам при підготовці до практичних, самостійних, підсумкових занять та
до іспитів:
1.Лекції, що читаються на кафедрі.
2.Л.М.Вороніна, В.Ф.Десенко, Н.М.Мадієвська. "Біологічна хімія", Харків,
2000.
3.Е.А.Строев, “Биологическая химия”,Москва,1986.
4.Ю.І.Губський, “Біологічна хімія", Київ-Тернопіль, 2000.
5.Я.І.Гонський, Т.П.Максимчук, М.І.Калинський ”Біохімія людини”,
Тернопіль, ”Укрмедкнига”, 2002.
6.Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин "Биологическая химия" - М.: Медицина.- 1990,
1998.
Додаткова література:
1.Калинин Ф.Л. «Основы молекулярной биологии». -К. Вища школа, 1978.
2.Мецлер Д. «Биохимия» - М.: Мир, 1980. - Т.1.-3
3.Ленинджер А. «Основы биохимии» - М. : Мир, 1985. - Т.1 - 3.
4.Страйер Л. “Основы биохимии” – М. Мир, 1985. – т. 1-3.
5.«Биохимия человека». Под ред Марри. – М. Мир, -1995. – т.1-2.
42.4. Методи біохімічних досліджень.
1. ФОТОМЕТРІЯ ТА ФОТОМЕТРИЧНА АПАРАТУРА.
Біохімічні аналітичні методи частіше всього закінчуються кольоровою
реакцією, в результаті якої прозорий розчин набуває забарвлення, тобто здатність
вибірково поглинати (адсорбувати) світло з певною довжиною хвилі. Для аналізу
використовують тільки ті кольорові реакції, в яких розвивається забарвлення,
пропорційне концентрації досліджуваної речовини. За допомогою фотометрії
визначають екстинцію, або оптичну густину розчину. Більшість фотометричних
приладів побудовано так, що вони безпосередньо вказують на цю величину.
Фотометричні прилади поділяються на 2-і великі групи: фотометри і
спектрофотометри.
В фотометрах необхідні спектральні діапазони виділяються за допомогою
світлофільтрів, тому число ділянок спектра, в якому може проводитись
вимірювання, дорівнює числу світлофільтрів.
В спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм
або дифракційних грат, тому можна встановити любу довжину хвилі в
заданому діапазоні. Зазвичай спектрофотометри – це прилади більш високого
класу, ніж фотометри, в них можна виділити більш вузьку (більше
монохроматичну) ділянку спектра, проте все залежить від конкретної
конструкції приладу.
Принцип роботи ФЕК
Фотоелектроколориметр застосовується для визначення концентрації
забарвлених розчинів по їх здатності до світлопропускання (оптична густина).
Прилад працює від сітки перемінного струму через спеціальний постачальний
пристрій. В якості джерела світла в приладі використовують лампу “Л”
нажарювання (для роботи у видимій частині спектру) та ртутно-кварцеву лампу
високого тиску (для вимірювання в ультрафіолетовій частині спектру).
Принципова схема будови приладу:
5В основу роботи приладу покладено принцип порівняння інтенсивності
двох пучків світла при допомозі щілинної діафрагми "Д". Світлові пучки від
лампи "Д" відображуються від дзеркала "З1" і "З2", проходять через
світлофільтри "С1" та "С2", що забезпечують таку довжину хвилі, до якої
фотоелементи найбільш чутливі, кювети "А1" та "А2" з досліджуваним
забарвленим розчином і розчинником, а потім потрапляють на фотоелементи "Ф1"
та "Ф2". Останні підключені до гальванометра. Внаслідок поглинання світла
забарвленим досліджуваним розчином, що знаходиться в кюветі "А2", на
фотоелемент "Ф2" буде потрапляти пучок світла меншої інтенсивності, ніж на
фотоелемент "Ф1", і стрілка гальванометра буде відхилятися. Величину
послаблення світлового потоку показує зв’язаний з щілинною діафрагмою "Д"
відрахунковий барабан. Виражається вона в одиницях оптичної густини
(екстинкціях), величина яких прямо пропорційна концентрації досліджуваної
речовини в розчині.
Користуючись калібрувальним графіком, по екстинції відрахункового
барабану визначають невідому концентрацію речовини в досліджуваному
розчині.
Для побудови калібрувальної кривої вимірюють оптичну густину ряду
розчинів досліджуваної речовини з відомими концентраціями.
2. ФЛЮОРОМЕТРІЯ
Ефект флюоресценції полягає в тому, що досліджуваний об`єкт світиться
під впливом опромінення світлом з більш короткою довжиною хвилі. Світло,
що випромінюється, називається світлом флюоресценції або вторинним
випромінюванням. Те світло, яким об`єкт опромінюється, називається світлом
збудження флюоресценції або первинним.
Форма спектра флюоресценції звичайно дзеркально відображає форму
спектра збудження, при цьому спектр збудження флюоресценції наближується
до спектру поглинання розчину і тому характерний для даного флюорофора, в
той час, як спектр флюоресценції малоспецифічний.
Під час флюорометрії довжина хвилі вторинного випромінювання,
звичайно, встановлюється на максимум інтенсивності, так як цей вид
випромінювання малоспецифічний, в той час як довжина хвилі первинного
світла (збудження флюоресценції) повинна приходитись на найбільш
специфічну для досліджуваної речовини ділянку спектру, що співпадає з
максимумом (речовини, що заважають, можуть бути причиною хибного
максимуму).
Фізичний ефект флюоресценції полягає в тому, що молекула речовини, яка
досліджується, поглинає квант світла і при цьому переходить в більший
енергетичний стан; через деякий проміжок часу вона випромінює надлишкову
енергію у вигляді кванту світла флюоресценції (емісії). В зв`язку з тим, що
енергія кванта світла обернено пропорційна довжині хвилі, довжина хвилі
збуджуючого світла завжди коротша, ніж та, що випромінюється. Проміжок
часу між поглинанням світла і його випромінюванням дуже малий, і в
6звичайних флуоресцентних методах на нього не звертають уваги, але він
достатній, щоб на молекулярному рівні встигли пройти деякі зміни, зокрема,
щоб молекула могла змінити своє розташування в просторі. На цьому
заснований метод молекулярної віскозиметрії шляхом вимірювання зміни
поляризації світла флюоресценції.
3. ПОЛУМ`ЯНА ФОТОМЕТРІЯ ТА АТОМНА АБСОРБЦІОМЕТРІЯ.
Солі металів, потрапляючи в полум`я, здатні забарвлювати його. Це
відбувається тому, що, при високій температурі полум`я, молекули
розкладаються на окремі іони, електрони яких безперервно переходять із
одного квантового стану в інший, що спряжено з випроміненням чи
поглинанням кванта світла. Мінімальна температура, яка необхідна для того,
щоб ці процеси проходили достатньо інтенсивно, залежить від природи
досліджуваного елемента і в меншій мірі від того, в склад якої сполуки в
розчині воно входить. Деякі елементи, наприклад, калій і натрій, починають
інтенсивно випромінювати світло, потрапляючи в полум`я з відносно низькою
температурою, яке утворюється при згоранні метану в повітрі (так зване
метаново-повітряне полум`я), а інші, наприклад кальцій, починають інтенсивно
випромінювати світло і поглинати його лише при значно вищій температурі,
яка утворюється при згоранні ацетилену. При згоранні метану (тобто
побутового газу) на повітрі можна визначити кальцій лише після його
попереднього виділення, але ця методика є складною, ненадійною і практично
не використовується.
Метод, в якому вивчається забарвлення полум`я, тобто випромінення, яке
виникає в результаті переходу атома із енергетично більш високого стану в
низький, називається полум`яною фотометрією. Можна вивчати і зворотній
процес, тобто вимірювати поглинання світла при переході атома з більш
низького на більш високий енергетичний рівень; цей метод називається
атомною абсорбціометрією.
Апаратура, яка необхідна для полум`яної фотометрії , відносно проста і
дешева, але метод виправдовує себе лише при дослідженні найбільш
легкозбудливих лужних елементів – літію, натрію, калію, так як можливо
працювати з легкодоступним низькотемпературним полум`ям, яке утворюється
при згоранні побутового газу. Хімічні методи визначення цих елементів
складні і неточні, тому калій і натрій визначають в клінічних лабораторіях
практично лише шляхом полум`яної фотометрії .
4. ЕЛЕКТРОФОРЕЗ
Для фракціонування білкових сумішей, що знаходяться в розчині, широке
застосування отримали методи дрібного осадження, засновані на зміненні
розчинності білків в присутності розчинів солей і органічних розчинників. При
фракціонуванні солями частіше всього використовують сірчанокислий амоній,
7що дозволяє створювати високу іонну силу розчину при низькій температурі, а
з органічних розчинників – етиловий спирт і ацетон. На відмінностях в
розчинності білків засноване також ізоелектричне осадження, що досягається
за рахунок мінімальної розчинності глобулярних білків в ізоелектричній точці.
В останній час для фракціонування білків все частіше використовують
центрифугування, вибіркову адсорбцію, різні види хроматографії та
електрофорезу.
Електрофоретичне розділення білків.
Метод заснований на тому, що молекули білка мають електричний заряд,
величина і знак якого визначаються амінокислотним складом білка, рН та
іонною силою оточуючого середовища. Під впливом зовнішнього
електричного поля заряджені молекули пересуваються в розчині до
протилежно зарядженого полюсу. Швидкість переміщення білкових частин
пропорційна величині їх заряду і зворотно пропорційна розміру частинок і
ступеню їх гідратації.
Широке розповсюдження в теперішній час отримав так званий
“зональний електрофорез” – електрофорез на твердому носії ( на паперових
смугах, агарі, крохмалі, акриламіді), що просякнутий буферним розчином з
потрібним значенням рН. Розташування білків на папері або гелі визначають
шляхом фіксації і наступного забарвлення тим чи іншим барвником ( звичайно
бромфеноловим синім, амідовим чорним або кумасі синім). Кількість білка в
кожній фракції можна орієнтовно визначати за інтенсивністю забарвлення
зв`язаного барвника. Таке визначення не дає строго кількісного
співвідношення білкових фракцій, так як кількість барвника, зв`язаного
різними білками неоднакова.
Виділяють:
- електрофорез на папері,
- електрофорез в агаровому гелі,
- електрофорез в поліакриламідному гелі.
Апарат для електрофорезу на плівці з ацетату целюлози (ЕПАУ – 20 – 50)
призначений для розділення білків сироватки крові на плівках із ацетату
целюлози. Апарат дозволяє виконувати електрофорез у мікроваріанті, що
забезпечує значну економію реактивів і електроенергії. Устаткування
складається із електрофоретичної камери, яка зроблена з органічного скла і
джерела постійного струму. Експериментальний завод науково-дослідного
інституту синтетичних смол виготовляє ацетатцелюлозні плівки необхідних
розмірів; найзручніше використовувати плівки розміром 9;9см, що дає
можливість наносити послідовно від 4 до 7 зразків. Плівки витримують в
розчині буферу, який застосовується для електрофорезу. Для одержання 5
фракцій рекомендується веронал-медіналовий буфер чи медінал-цитратний
буфер рН=8,6. Для візуальної оцінки електрофореграм, а також прямого
денситометрування, достатньо 1-2мкл сироватки; елюювання фракцій з
наступним фотометруванням потребує 3-4мкл сироватки. Електрофоретичне
розділення проводять при напрузі 200V на протязі 20хв. з подальшим виміром
8на денситометрі. Денситометр ДМ-1 призначений для фотометрування
забарвлених фореграм, одержаних методом диск-електрофорезу.
5.ХРОМАТОГРАФІЯ.
Хроматографія – метод розділення газів, парів, рідин і розчинних речовин
на межі двох фаз – рухомої і нерухомої.
За механізмами розділення хроматографію поділяють на
адсорбційну(газову або рідинну),осадову, іонообмінну, розподільчу, гель-
фільтраційну(гель-хроматографію) і біоспецифічну (афінну) ; по формі
проведення – на колонкову, хроматографію на папері і тонкошарову. Для
фракціонування білків застосовується головним чином хроматографія на
колонках.
Хроматографія на папері – один із видів розподільної хроматографії.
Метод базується на різниці коефіцієнтів рухливості роздільних речовин між
двома погано змішуваними розчинниками. В якості носія нерухомої фази
використовують спеціальний хроматографічний папір. Він повинен бути
хімічно чистим, однорідним по густині і забезпечувати визначену швидкість
руху розчинника. Досліджувану речовину, що знаходиться в розчині, наносять
у вигляді крапель на деякій відстані від краю на листок хроматографічного
паперу. Папір розміщують в герметично закриту камеру і занурюють край
листка, де був нанесений досліджуваний розчин, в кювету, що містить
органічний розчинник. Лінія старту з нанесеними на неї пробами не повинна
занурюватись в розчинник.
За силами капілярності органічний розчинник буде рухатись вздовж
листка хроматографічного паперу. Нанесена на папір речовина рухається за
розчинником. Ступінь сорбції досліджуваної речовини на гідратованих
волокнах паперу (повітряно-сухі листки фільтрувального паперу в камері,
насиченої парами водонасиченого органічного розчинника, містить до 20%
води) визначає швидкість його руху. Речовини, що гірше сорбуються на
гідратованих волокнах паперу, будуть рухатися швидше. Після проходження
фронтом розчинника певної відстані папір висушують і обробляють тою чи
іншою проявляючою речовиною. Паралельно з дослідним розчином на цей
листок паперу наносять стандартний розчин досліджуваної речовини (свідок),
який буде вказувати місце знаходження речовини, що визначається. Для
ідентифікації речовини можна також користуватися величиною Rf, яка
являється відношенням відстані, яку дана речовина пройшла, до відстані, яку
пройшов фронт розчинника. Велична Rf залежить від розчинника. Розрізняють
висхідну (розчинник піднімається по паперу вверх) і низхідну (розчинник
рухається вниз) хроматографію.
Загальні прийоми хроматографічного розділення на колонках.
Найпростіший пристрій для хроматографічного розділення має наступну
будову : колонки – порожні скляні трубки, розмір яких залежить від мети
роботи і способу розділення . В основі колонки вмонтовано пористу скляну
9пластинку або перфорований диск. Необхідно слідкувати за тим, щоб
“мертвий” простір під диском, між ним і основою колонки, а також внутрішній
діаметр шлангів, по яких елюат, що виходить із колонки, потрапляє в колектор
фракцій, був мінімальним. В зворотному випадку відбувається змішування вже
розділених речовин. Комерційні колонки оснащені спеціальними
пристосуваннями – кінцевими адаптерами перемінної довжини, які дозволяють
регулювати довжину колонки і зводять до мінімуму перемішування фракцій,
що підлягають елююванню.
Метод тонкошарової хроматографії
Принцип: ванілін – мигдальну кислоту(ВМК) екстрагують із сечі
етилацетатом, екстракт випарюють і піддають тонкошаровій хроматографії на
силікагелі. Для виявлення на хроматограмах і кількісного визначення
використовують кольорову реакцію з діазотованим п-нітроаніліном.
Для проявлення пластин, їх після висушування обприскують проявляючим
діазореактивом. При цьому у самого фінішу видно пляму гомованілінової
кислоти, пляма ВМК знаходиться приблизно на 4 см вище лінії старту, вона
забарвлюється в світлофіолетовий колір. Плями зіскоблюються в пробірки,
куди додають по 2мл метанольного лугу і 0.1 мл підсилюючого діазореактиву.
Ретельно перемішують і через 20 хв. центрифугують, надосадову рідину
фотометрують при трьох довжинах хвиль: 350нм; 520нм і 590нм супроти
екстрактів із зіскобів пластинок в ділянках, де немає ВМК.
Одночасно з дослідними пробами через всю процедуру аналізу
пропускають калібровані проби, що містять 4; 6 і 8мкг ВМК. Для цього 0,04-
0,08мл каліброваного розчину, що містить ВМК в концентрації 100мкг/мл,
виливають в порції по 1мл ацетатного буферу рН=1,96, потім екстрагують
етилацетатом так само, як і дослідні проби. Для розрахунку спочатку
вираховують виправлену величину екстинції з поправкою на неспецифічне
поглинання по формулі:
Е=Е520-1/2 • (Е350 + Е590)
як для дослідних, так і для калібрувальних проб. За цими даними будують
графік, який служить для безпосереднього розрахунку вмісту ВМК в сечі в
мікрограмах в 1мл.
6. ІМУНОФЕРМЕНТАТИВНИЙ МЕТОД
Відзначається надзвичайною чутливістю. Застосовується для кількісного
визначення тих низькомолекулярних речовин, які знаходяться в біологічних
об’єктах в дуже низьких концентраціях ( гормони, вітаміни В8,В9,В12, отруйні
речовини і т.п.), та для проведення фармакокінетичного аналізу лікарських
препаратів. Наводимо один із варіантів методу на прикладі визначення в
сироватці крові кількості вітаміну В12. На поверхню поліетиленової лунки
міцно пришивають антитіла до вітаміну В12. Далі в лунку вносять досліджувану
рідину, що містить вітамін В12. Цей вітамін зв’язується з антитілами до нього,
10але частина антитіл залишається вільними. Вміст лунки відмивають
фізрозчином від сторонніх речовин, потім в цю ж лунку додають стандартний
розчин, в якому вітамін В12 зв’язаний з ферментом, найчастіше з дуже
активним ферментом - пероксидазою. Комплекс В12 - пероксидаза зв’язується з
антитілами до вітаміну В12, які залишилися вільними, разом з вітаміном
адсорбується і фермент. Після відмивання від надлишку комплексу В12
-пероксидаза процедура визначення вітаміну В12 в досліджуваній рідині
полягає у визначенні активності ферменту пероксидази, яка з’явилася на
поверхні полістиролових лунок. Чим більше ферменту адсорбувалося в лунці,
тим менше вітаміну В12 знаходилося в досліджуваній рідині. Для контролю
використовують стандартні розчини вітаміну В12 відомої концентрації.
7.БІОХІМІЧНІ АНАЛІЗАТОРИ
В наш час в клінічних лабораторіях широко використовуються біохімічні
автоматичні та напівавтоматичні аналізатори. Вони дозволяють одночасно
визначати десятки різних біохімічних показників: загальний білок та його
фракції, глюкозу, К
+
, Na
+
, Cl
--
, холестерин, загальні ліпіди, тригліцериди,
сечовину, сечову кислоту, білірубін, креатин, активність ферментів: АСТ, АЛТ,
ЛДГ, креатинфосфокіназу, лужну фосфатазу, альфа-амілазу та ін. В
аналізаторах використовуються відповідні готові комплекти хімічних
реактивів.
Відомі такі біохімічні аналізатори: ”KONE SPECIFIC BASIC”,
селективний біохімічний автоаналізатор ”SUPER Z-818 Mitsubishi Corporation”
(Японія), автоматичний біохімічний аналізатор ”BTS–370” фірми Biosystems
(Іспанія), напівавтоматичний біохімічний аналізатор ”EPOLL-20”. Аналізатор
”Ексан-Г” призначений для експрес-аналізу глюкози в пробах цільної крові та
інших біологічних рідинах. Принцип дії вказаного аналізатора оснований на
електрохімічному амперометричному визначенні продуктів ферментативної
реакції окислення глюкози під впливом глюкозооксидази.
11РОЗДІЛ І
Хімія амінокислот та простих білків
А. Питання для підготовки з теоретичного матеріалу
1.Біохімія як наука, загальнобіологічне та медичне значення. Значення біохімії
в підготовці сучасного спеціаліста з фармації.
2.Біохімічні методи дослідження. Принципи організації і функціонування
живої матерії.
3.Поняття про білки, їх елементарний склад, вміст в органах та тканинах.
Значення та функції білків.
4.Класифікація білків: прості та складні.
5.Типи зв`язків в білкових молекулах.
6.Рівні структурної організації білків.
7.Фізико-хімічні властивості білків.
8.Методи визначення білків.
9.Амінокислоти як мономери білків: визначення, номенклатура. Види ізомерії.
10.Класифікація амінокислот.
11.Фізико-хімічні властивості амінокислот.
12.Білки та амінокислоти як лікарські препарати.
13.Принципи методів визначення білка та його фракцій в сироватці крові.
Б.Література:
1.Л.М.Вороніна та співавт. “Біологічна хімія”, Х., «Основа», 2000, С.4-56.
2.Е.А.Строев. “Биологическая химия”, М.1986, С.3-15,24-60.
3.Ю.І.Губський. ”Біологічна хімія”, 2000, С.7-13,18-40.
Лекції, що читаються на кафедрі.
4.Я.І.Гонський та співавтори ”Біохімія людини”, Тернопіль, ”Укрмедкнига”,
2002, С.7-52.
В.Опис лабораторних робіт
Реакції осадження білків
Робота 1.1 Осадження білків при нагріванні
Принцип Майже всі білки денатурують при нагріванні до 56оС та вище.
Механізм теплової денатурації пов'язаний зі зміною структури білкової
молекули, в результаті якої білок втрачає свої нативні властивості,
зменшується його розчинність (зменшення гідрофільних властивостей веде до
руйнування гідратної оболонки).
Найбільш повне та швидке осадження проходить в ізоелектричній точці
білка, тобто при значенні рН, коли колоїдні частинки білка електронейтральні і
є найменш стійкі. Для більшості білків ізоелектрична точка знаходиться в
слабко кислому середовищі.
В сильно кислих розчинах (за виключенням розчинів нітратної,
трихлорацетатної кислот) при нагріванні білок не випадає в осад, тому що
частинки білка перезаряджаються (або відбувається посилення існуючого
заряду), що підвищує їх стійкість в розчині. Але в сильно кислих розчинах
12білки при нагріванні можуть осаджуватись, якщо додати достатню кількість
будь-якої нейтральної солі електроліту. Іони солі адсорбуються на частках
білка, нейтралізують заряд, і білок випадає в осад.
Хід роботи. В 5 пронумерованих пробірок наливають по 1 мл 1% розчину
білка. Вміст першої пробірки нагрівають на кип`ячій водяній бані. Випадає
осад. В другу пробірку додають 2 краплі 3% розчину ацетатної кислоти і вміст
нагрівають. Випадає осад білка.
В третю пробірку наливають 3 краплі 10% розчину ацетатної кислоти і
вміст нагрівають. Осад білка не утворюється навіть при кип'ятінні. В четверту
пробірку приливають 3 краплі 10% розчину ацетатної кислоти та декілька
кристалів натрію хлориду. Кип'ятять. Утворюється осад білка. В п'яту пробірку
добавляють 3 краплі 10% розчину натрію гідроксиду та нагрівають. Осад білка
не утворюється навіть при кип'ятінні.
Робота 1.2. Осадження білків солями важких металів
Принцип. При дії солей важких металів на розчини білка відбувається
денатурація білкової молекули. Осадження денатурованого білка обумовлено
адсорбцією важкого металу на поверхні білкової молекули та утворенням
нерозчинних комплексів.
Хід роботи. В три пробірки наливають по 1 мл 1 % розчину білка і по 2
краплі: в першу пробірку - 10% розчину аргентум(І)нітрату срібла, в другу - 5%
розчину плюмбум(ІІ)ацетату, в третю - 5 % розчину купрум(ІІ) сульфату. В усіх
пробірках утворюється осад. Потім в кожну пробірку доливають надлишок (5-
10 крапель) того ж реактиву і відмічають, в якій пробірці пройшла пептизація
білка, тобто його розчинення.
Клініко-діагностичне значення
Властивість білків зв'язувати важкі метали використовується медичною
практикою. Білки застосовуються як протиотрута при отруєнні солями ртуті,
свинцю, міді та іншими металами. Білок обмежує всмоктування важкого
металу, утворюючи з ним нерозчинні комплекси. Слід відзначити, що при
осадженні білків деякими солями важких металів (плюмбум(ІІ)ацетату,
купрум(ІІ)сульфату), відбувається пептизація (розчинення) утвореного осаду,
що пов'язано з надлишковою адсорбцією важкого металу на поверхні колоїдної
частинки та появою позитивного заряду на молекулі білка. При умові
надлишку солей срібла та ртуті пептизація не спостерігається.
Робота 1.3. Осадження білків реактивами на алкалоїди
Принцип. Осадження білків реактивами на алкалоїди зумовлено наявністю
в молекулі білка гетероциклічних груп, аналогічних тим, які знаходяться в
молекулі алкалоїдів (пірольних, індольних, імідазольних та інших). Більш
повне осадження спостерігається при перезарядженні білкової молекули на
позитивний заряд (підкислення), що полегшує взаємодію білка з від’ємно-
зарядженими іонами осаджувача.
13Хід роботи. В три пробірки наливають по 1 мл 1 % розчину білка і по 2
краплі 2% розчину ацетатної кислоти. В першу пробірку добавляють 3 краплі
5% розчину таніну, в другу - 5 крапель 10% розчину пікринової кислоти, в
третю - 3 краплі 5% розчину залізистосинеродистого калію. В усіх пробірках
білок випадає в осад.
Клініко-діагностичне значення
При лікуванні опіків застосовують обробку цими реактивами уражених
областей, що веде до денатурації білків та утворення захисного шару, що
перешкоджає зневодненню тканин та проникненню інфекції.
Робота 1.4. Осадження білків концентрованими мінеральними
кислотами
Принцип. Осадження білка концентрованими мінеральними кислотами
(крім фосфатної кислоти) відбувається в результаті дегідратації білкових
часток та нейтралізації їх зарядів.
Хід роботи. В пробірку наливають 16 крапель концентрованої нітратної
кислоти. Потім, нахиливши пробірку під кутом 45°, обережно по стінці
нашаровують 8-10 крапель 1% розчину білка. На межі розділу двох шарів
рідини виникає осад білка.
Клініко-діагностичне значення
Реакція осадження білка нітратною кислотою (реакція Геллера)
використовується в клінічних дослідженнях сечі на наявність та кількісний
вміст в ній білка за методом Стольнікова.
Робота 1.5 Осадження білків органічними кислотами
Принцип. Білки з розчину можуть осаджуватись органічними кислотами,
проте різні органічні кислоти діють по-різному. Механізм осадження білків
органічними кислотами пояснюється дегідратацією білкової молекули та
нейтралізацією заряду.
Хід роботи. В дві пробірки наливають по 1мл 1% розчину білка. В першу
пробірку добавляють 3 краплі 10% розчину трихлорацетатної кислоти, а в
другу - 3 краплі 10% розчину сульфосаліцилової кислоти. В пробірках
утворюється осад білка.
Клініко-діагностичне значення
Трихлорацетатна і особливо сульфосаліцилова кислоти є дуже чутливими
реактивами на білок і тому широко використовуються в клінічній практиці для
доказу наявності білка в біологічних рідинах.
За допомогою сульфосаліцилової кислоти можна виявити білок в сечі в
концентрації 0,0015%.
Робота 1.6. Висолювання білків
Принцип. Висолюванням називається процес осадження білків з їх водних
розчинів нейтральними розчинами концентрованих солей лужних та
лужноземельних металів: натрій сульфатом, амоній сульфатом, магній
14сульфатом, натрій хлоридом і т.д. При додаванні досить великих кількостей
цих солей до розчину білка відбувається дегідратація білкової молекули і
нейтралізація заряду.
Висолювання білків є зворотним процесом: після виведення солі шляхом
діалізу або розведенням водою білок знову розчиняється і володіє нативними
властивостями.
Хід роботи. В пробірку наливають 1 мл 1% розчину білка і декілька
крапель 80% розчину амоній сульфату (до утворення осаду). Через 2-3 хвилини
до отриманого осаду доливають 3-4 мл води, осад розчиняється.
Клініко-діагностичне значення
Метод висолювання білків використовують в клінічній практиці для
визначення окремих фракцій білків сироватки крові.
Робота 1.7. Осадження білків органічними розчинниками
Принцип. Білки осаджуються в багатьох органічних розчинниках (спирт,
ацетон, ефір і т. д.). Органічні розчинники дегідратують частинки білка і тим
самим знижують їх стійкість в розчині.
Короткочасна дія органічного розчинника зберігає білок в його природному
стані, тривала - веде до денатурації білка.
Хід роботи. В пробірку наливають 5 крапель розчину білка і додають 1 мл
спирту – розчин мутніє.
Клініко-діагностичне значення
Реакція має практичне значення: використовується в клінічній лабораторній
практиці для розділення білків сироватки крові за методом Кона.
Робота 1.8. Адсорбція білків на високодисперсному кремнеземі
(аеросилі)
Принцип. Аеросил є білим легким порошком з розміром часточок від 4 до
40 нм, які мають велику активну поверхню. Загальна формула аеросилу -
(SіО2)n.. Механізм дії аеросилу пов’язаний із здатністю швидко та міцно
адсорбувати великі кількості білка, у тому числі токсинів білкової природи.
При змішуванні водних розчинів з аеросилом білкові молекули адсорбуються
на поверхні часток аеросилу і разом з ним випадають в осад.
Хід роботи. Беруть дві пробірки, в кожну наливають по 3 мл 0,1% розчину
білка. В одну пробірку вносять попередньо заготовлену наважку аеросилу (15
мг), вміст пробірки перемішують протягом 1 хвилини. Далі вміст кожної
пробірки фільтрують через паперовий фільтр. З обома фільтратами виконують
якісну реакцію на білок з сульфосаліциловою кислотою (див. роботу 1.5.).
Фільтрат з пробірки, куди було внесено аеросил, дає негативну якісну реакцію
на білок, що говорить про повне осадження білка аеросилом; а фільтрат з
пробірки, куди не було внесено аеросил, дає позитивну якісну реакцію на
білок.
Клініко-діагногстичне значення
15З аеросилу виготовляють сучасні високоефективні сорбенти медичного
призначення (полісорб, сілард та інші).
Кольорові реакції на білки
Робота 1.9. Біуретова реакція
Принцип. В лужному середовищі, в присутності солей купруму, розчин
білка набуває фіолетового кольору. Біуретова реакція обумовлена наявністю в
молекулі білка пептидних груп, які в лужному середовищі утворюють
комплексні сполуки міді.
Хід роботи. В пробірку наливають 1мл 1% розчину білка, 5 крапель 10%
розчину натрій гідроксиду і 1-2 краплі 1% розчину купрум(ІІ)сульфату. В
пробірці з'являється фіолетове забарвлення.
Робота 1.10. Нінгідринова реакція
Принцип. Білки, поліпептиди, а також вільні ;-амінокислоти дають синє
або фіолетове забарвлення з нінгідрином. Реакція характерна для аміногрупи в
;-положенні та обумовлена наявністю ;-амінокислот в молекулі білка. При
нагріванні білка з водним розчином нінгідрину амінокислоти окислюються і
розщеплюються, утворюючи карбону діоксид, аміак і відповідний альдегід.
Відновлений нінгідрин конденсується з аміаком та окисленою молекулою
нінгідрину, утворюючи барвник типу мурексиду фіолетово-синього
забарвлення.
Хід роботи. На фільтрувальний папір наносять 1 краплю 1% розчину білка
і висушують над електроплиткою. Потім наносять на теж саме місце краплю
0,1% розчину нінгідрину і знову висушують. З'являється фіолетове
забарвлення.
Робота 1.11. Діазорекція
Принцип. Білки дають оранжово-червоне забарвлення з діазореактивом
(сульфанілова кислота, розчинена в концентрованій хлоридній кислоті).
Забарвлення залежить від утворення азосполук з залишком амінокислот -
тирозину, триптофану, гістидину, що входять до складу білкової молекули.
Хід роботи. В пробірку доливають 0,5 мл 1% розчину білка, 8 крапель 10%
розчину натрій карбонату і 16 крапель діазосуміші. Через 10 хвилин
утворюється оранжово-червоне забарвлення.
Робота 1.12. Реакція Фоля
Принцип. При добавленні до розчину білка 30% розчину натрій
гідроксиду, плюмбум(ІІ)ацетату з наступним кип'ятінням розчин починає
темніти. Реакція обумовлена присутністю в молекулі білка сірковмісних
амінокислот – цистеїну та цистину. Ці амінокислоти при нагріванні в
присутності натрій гідроксиду руйнуються і утворюють натрій сульфід (Nа2S).
16Плюмбум(ІІ)ацетат реагує з натрій гідроксидом з утворенням натрій
плюмбіту. Натрій сульфід взаємодіє з натрій плюмбітом і утворюється чорний
осад плюмбум(ІІ)сульфіду (РbS).
Хід роботи. В пробірку наливають 2 краплі 5% розчину
плюмбум(II)ацетату і добавляють по краплям 30% розчин натрій гідроксиду до
повного розчинення утвореного осаду. Потім добавляють рівний об'єм 1%
розчину білка та кип'ятять. Випадає осад чорного кольору.
Робота 1.13. Ксантопротеїнова реакція
Принцип. При додаванні до розчину білка концентрованої нітратної
кислоти білок спочатку випадає в осад, а потім при нагріванні розчиняється, і
рідина забарвлюється в жовтий колір. Поява забарвлення зумовлена
утворенням нітропохідних ароматичних амінокислот (фенілаланіну, тирозину,
триптофану). Нітропохідні амінокислот в лужному середовищі утворюють солі
хіноїдної структури, що забарвлені в оранжевий колір.
Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл 1% розчину білка, добавляють 5
крапель концентрованої нітратної кислоти і (обережно!) нагрівають. Рідина
забарвлюється в жовтий колір. Пробірку охолоджують, після чого додають 10
крапель концентрованого розчину аміаку.
Жовте забарвлення переходить в оранжеве.
Робота 1.14. Реакція Міллона
Принцип. При додаванні до розчину білка реактиву Міллона (розчин ртуті
в нітратній кислоті, що містить нітритну кислоту) білок випадає в осад, який
при нагріванні набуває червоно-коричневого забарвлення.
Реакція зумовлена наявністю в молекулі білка амінокислоти тирозину, що
має фенольне ядро, яке при взаємодії з реактивом Міллона утворює забарвлену
сіль свого нітропохідного. Реакцію Мілона дають всі білки, за виключенням
тих, які не містять тирозин (желатин, клупеїн та інші).
Хід роботи. В пробірку наливають 1 мл 1% розчину білка, додають 2-3
краплі реактиву Міллона, кип'ятять. Утворюється осад рожевого кольору.
Робота 1.15 Розділення альбумінів та глобулінів сироватки крові та їх
кількісне визначення
Принцип. Розділення білків проводиться методом висолювання (див.
роботу 1.6.). Для розділення білків цим методом широко використовується
амоній сульфат. Глобуліни випадають в осад в напівнасиченому розчині солей,
альбуміни - в насиченому. Концентрацію окремих фракцій білків визначають
колориметрично по інтенсивності біуретової реакції.
Хід роботи. В пробірку наливають 2 мл сироватки крові (розведеної в 2
рази) і додають 2 мл насиченого розчину амоній сульфату (50 % насичення
розчину). Перемішують і залишають на 5 хвилин. В напівнасиченому розчині
амоній сульфату в осад випадає фракція глобулінів, які мають відносно велику
молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. Осад глобулінів на
17фільтрі поступово змивають в чисту мірну пробірку 4 мл дистильованої води, а
потім доводять вміст пробірки водою до мітки 5 мл. З цього об'єму відбирають
2 мл розчину в другу пробірку, добавляють 5 крапель 30% розчину натрій
гідроксиду і використовують для кількісного визначення глобулінів (проба А).
До фільтрату, що залишився після відокремлення глобулінів, які осадилися,
додають кристалічний амоній сульфат до повного насичення розчину. Фракцію
альбумінів, що осадилися, відокремлюють фільтруванням. Відсутність білка в
фільтраті перевіряють реакцією з сульфосаліциловою кислотою (див. роботу
1.5).
Для визначення вмісту білка в досліджуваній сироватці крові в пробірку
наливають 0,25 мл сироватки (розведеної в 2 рази) і добавляють 1,75 мл
дистильованої води (проба Б).
В пробірку, що є контролем, вносять 2 мл дистильованої води. До проби А,
Б і в контроль одночасно добавляють по 2 мл біуретового реактиву. Вміст всіх
пробірок перемішують і залишають на 10 хвилин для розвитку забарвлення.
Інтенсивність забарвлення проб А і Б визначають на фотоелектроколориметрі
(ФЕК) при зеленому світлофільтрі в кюветі товщиною 0,5 см проти контролю.
Кількість білка (в мг) визначається за калібрувальним графіком.
Розрахунок маси глобулінів - (Х) проводиться згідно з формулою:
С • 5 • 2 • 1000
Х = г/л, де
2 • 2 • 1000
в чисельнику:
С- маса білка в мг, знайдена за калібрувальною графіком;
5 - об'єм розчину глобулінів в мл;
2 - розведення сироватки крові;
1000 - перерахунок мл в л;
в знаменнику:
2 - об'єм, взятої для дослідження сироватки в мл;
2 – об`єм фільтрату глобулінів, взятого для колориметрування;
1000 - перерахунок мг в г.
Розрахунок загальної кількості білка - (Y) здійснюються за формулою:
С • 2 • 1000
Y= г/л, де
0,25 • 1000
в чисельнику:
С - маса білка в мг, знайдена за калібрувальним графіком;
2 - розведення сироватки крові;
1000 - перерахунок мл в л;
в знаменнику:
0,25 - об'єм взятої для дослідження сироватки в мл;
1000 - перерахунок мг в г.
18Маса альбумінів визначається по різниці між масою загального білка і
глобулінів.
Клініко-діагностичне значення
Метод висолювання використовують в клінічній практиці для розділення
білків сироватки крові на фракції: альбуміни, глобуліни, фібриноген.
В нормі в сироватці крові міститься: альбумінів - 40-50 г/л; глобулінів - 20-
30 г/л; загальна кількість білка - 60-80 г/л.
Зниження загальної кількості білка (гіпопротеінемія) та альбумінів
(гіпоальбумінемія) виникає внаслідок: недостатнього надходження в організм
білка (голодування); захворюваннях нирок; крововтратах; пухлинах;
захворюваннях печінки, що супроводжуються порушенням синтезу білка.
Підвищення загальної кількості білка (гіперпротеінемія), а також
альбумінів (гіперальбумінемія) виникає при: дегітратації (травми, опіки,
холера); появі патологічних білків.
Вміст ;-глобулінів підвищується при різних хронічних інфекційно-
запальних захворюваннях; пухлинах; травмах; інфарктах; ревматизмі. ;-
глобуліни збільшуються при атеросклерозі, цукровому діабеті, гіпотиреозі,
нефротичному синдромі. ;-глобуліни збільшуються при інфекційних
захворюваннях, а зменшуються при виснаженні імунної системи.
Робота 1.16 Звільнення біологічних рідин від білка
Принцип та клінічне значення. В практичній роботі біохімічних
лабораторій іноді виникає необхідність визначати в крові та інших біологічних
рідинах різні низькомолекулярні речовини. Присутність білків заважає такого
роду досліджень. Тому попередньо звільняють рідину від білків. В даній роботі
необхідно визначити реактив, який найбільш повно осаджує білки.
Хід роботи. В 5 пробірок доливають по 1 мл 1% розчину білка. В першу
пробірку доливають 10 крапель 8% розчину трихлорацетатної кислоти. В другу
пробірку доливають 10 крапель 5% розчину метафосфатної кислоти. В третю -
10 крапель 8% розчину натрій вольфрамату і 10 крапель розчину сульфатної
кислоти з Сн=1/3. В четверту - 1 краплю 10% розчину ацетатної кислоти та
кип'ятять. В п'яту – 5 мл 0,45% розчину цинк сульфату і 1 мл 0,1М розчину
натрій гідроксиду та кип'ятять. Після утворення осаду білка вміст кожної
пробірки фільтрують. З кожним фільтратом проводять якісну реакцію на білок
з сульфосаліциловою кислотою (див. роботу 1.5). Від'ємна реакція на білок
говорить про повне осадження білка даним реактивом.
Робота 1. 17. Розділення суміші амінокислот методом хроматографії на
папері
Принцип. Метод хроматографії на папері заснований на різниці в
коефіцієнті рухливості (Rf) амінокислот чи інших речовин між органічною та
водною фазами.
А
19Rf = ,
В
де: А - відстань, пройдена амінокислотою,
В - відстань, пройдена фронтом розчинника.
Коефіцієнт рухливості є характерною величиною для кожної амінокислоти
і постійний за даних умов досліду.
Значення Rf амінокислот при радіальній хроматографії для Н - бутанового
розчинника:
Амінокислоти Величина Rf
1. Цистеїн
2. Лізин
3. Аспарагінова кислота
4. Глутамінова кислота
5. Аланін
6. Пролін
7. Валін
8. Метионін
9. Лейцин
0,30
0,34
0,46
0,51
0,61
0,64
0,82
0,84
0,98
Хроматографічне визначення амінокислот на папері проводять в чашці
Петрі за допомогою паперового диску, де розчинник переміщується по радіусу.
Досліджувані амінокислоти наносять в центр паперового диску, розчинник
захоплює амінокислоти, які розподіляються концентричними колами. Після
висушування над електроплиткою та проявлення нінгідрином, на хроматограмі
з'являються плями різного кольору. Кожна пляма відповідає окремій
амінокислоті. Співставляючи положення плям досліджуваного розчину з
положенням плям відомих амінокислот - "свідків", визначають наявність тих
або інших амінокислот у досліджуваній суміші.
Хід роботи. На паперовому диску на відстані 2 см від центру проводять
простим олівцем коло - лінію старту та відмічають на ній 4 крапки А, Б, В, Г на
рівній відстані одна від одної. В центрі диску роблять невеликий отвір. На
крапку А наносять скляним капіляром 0,5 % розчин досліджуваних
амінокислот, а на крапку Б, В, Г наносять 0,5 % розчин відповідних
амінокислот – ”свідків”: проліну, лейцину та аспарагіновою кислоти. Після
чого паперовий диск висушують над електроплиткою. В отвір диску
вставляють трубочку довжиною 1,5см зроблену з хроматографічного паперу.
Накладають паперовий диск на край чашки Петрі, в яку попередньо наливають
розчинник, що складається з бутанолу, ацетатної кислоти і води у
співвідношенні 8:3:1. Паперова трубочка при цьому повинна бути занурена в
розчинник. Чашку Петрі накривають кришкою і залишають при кімнатній
температурі на 30-50 хвилин. Після цього відмічають олівцем відстань, на яку
просунувся фронт розчинника. Диск висушують над електроплиткою. На
хроматограму наносять 0,25% розчин нінгідрину в ацетоні в горизонтальному
положенні за допомогою пульверизатора і знову висушують над
електроплиткою. Проявляються забарвлені плями, які відповідають нанесеним
на хроматограму амінокислотам. Ідентифікують невідомі амінокислоти, що
20були нанесені в точку А по забарвлених плямах амінокислот - ”свідків” або
вираховуючи для кожної амінокислоти коефіцієнт рухливості (Rf).
Робота 1.18. Кількісне визначення білка за методом Лоурі
Принцип: Заснований на властивості білків утворювати забарвлені
комплекси синього кольору при сумісній дії двох кольорових реакцій -
біуретової і реакції Фоліна (відновлення білками суміші фосфатно-
вольфрамової та фосфатно-молібденової кислот - реактиву Фоліна). Метод
відзначається високою чутливістю (виявляє до 10 – 100 мкг білка в пробі).
Інтенсивність забарвлення комплексів вимірюють на фотоелектроколориметрі
(ФЕК) при довжині хвилі 750 нм чи на спектрофотометрі.
Вміст білка в досліджуваній пробі визначають за калібрувальним графіком,
побудованим шляхом вимірів оптичної густини (екстинкції) ряду розчинів з
відомою концентрацією білка. По осі ординат відкладають екстинкцію, по осі
абсцис - відомі концентрації білка
Ext
0,4
0,3
0,2
0,1
0 5 10 15 20 C (мкг/мл)
Хід роботи. Для аналізу беруть дві пробірки (дослідну і контрольну). В
дослідну вносять 0,4 мл розведеної в 1000 разів сироватки крові, а в
контрольну – 0,4 мл фізіологічного розчину. В обидві пробірки доливають по 2
мл біуретового реактиву. Через 10 хв. додають по 0,2 мл реактиву Фоліна і
через 30 хвилин вимірюють інтенсивність забарвлення, що з'явилося в
дослідній пробірці проти контроля на ФЕК.
Вміст білка визначають за формулою:
С • 1000 • 1000
Х = =.. (г/л) , де:
0,4 • 1000000
С - маса білка за калібрувальним графіком, мкг/мл;
0,4 – кількість сироватки крові, взятої для досліду, мл;
1000, 1000, 1000000 – коефіцієнти перерахунку мкг/мл в г/л.
Клініко-діагностичне значення
Дивись роботу 1.15.
2122Робота 1.19 Визначення ізоелектричної точки білків
Принцип: Внаслідок наявності здатних до іонізації функціональних груп
амінокислот (-СООН, -NН2 ) молекули білка володіють електричним зарядом:
позитивним (якщо переважають NН
+
3 заряди), негативним (якщо переважають
СОО
-
заряди) і рівним “нулю” (якщо сума NН
+
3 дорівнює сумі СОО
-
зарядів). В
кислому середовищі білки мають сумарний позитивний заряд: в лужному
середовищі - негативний.
При певному значенні рН середовища позитивний і негативний заряди
стають однаковими і сумарний заряд молекули дорівнює нулю. Значення рН,
при якому білок електронейтральний (заряд рівний “нулю”), називають
ізоелектричною точкою (IЕТ). В цьому стані білок володіє найменшим
значенням в'язкості, розчинності, ступеня гідратації та електропровідності, не
спроможний пересуватися в електричному полі. Кожен білок має свої значення
IЕТ: казеїн - 4,6 -4,7; сироваточний глобулін - 5,4; протаміни - 10-12 і т.д. Існує
цілий ряд засобів визначити IЕТ білків.
Хід роботи: В кожну пробірку з 8 пронумерованих згідно означеної схеми
(табл.1) вносять відповідні розчини.
В тій пробірці, де спостерігається максимальне помутніння вмісту
(візуально або нефелометрично), рН розчину буде відповідати ізоелектричній
точці білка.
Таблиця 1
Об`єм, мл Номера пробірок
1 2 3 4 5 6 7 8
Вода
0,01N розчину
СН3СООН
0,1N розчину
СН3СООН
розчину білка
8,40
0,60
-
1,0
7,75
1,25
-
1,0
8,75
-
0,25
1,0
8,50
-
0,50
1,0
8,00
-
1,0
1,0
7,00
-
2,0
1,0
5,00
-
4,0
1,0
1,00
-
8,0
1,0
рН 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8
Робота 1.20. Визначення вмісту аргініну в біологічному матеріалі
Принцип: Метод заснований на реакції Сакагуті, що полягає в утворенні
забарвленої комплексної сполуки аргініну з ;-нафтолом. Даний метод дозволяє
визначати вміст як вільного аргініну, так і зв'язаного в білках.
Хід роботи. 1 г паростків розтирають з кварцевим піском або товченим
склом та добавляють 5 мл 80% етанолу, центрифугують 5 хв. при 3000 об/хв.
До 1 мл супернатанту (або розчину яєчного білка, або плазми крові)
добавляють 1 мл спиртового розчину ;-нафтолу, 1 мл 10% розчину КОН,
змішують і добавляють 1 мл 5% розчину сечовини. Після перемішування при
безперервному збовтуванні швидко приливають 2 мл розчину КВrО. Суміш
23залишають на 20 хв. Оптичну густину вимірюють при 520 нм супроти
контролю, в якому екстракт або розчин білка замінені 1 мл дистильованої води.
Концентрацію аргініну розраховують за калібрувальним графіком,
побудованим з використанням стандартного розчину, що містять 1 мкМ
аргініну в 1 мл.
Робота 1.21. Видiлення фібриногену з плазми
Фібриноген міститься в плазмі (2-4 г/л). Його молекулярна маса біля
330000. Молекули фібриногену мають видовжену форму з відношенням осей
20:1. Розчини фібриногену дуже в’язкі, що зумовлено формою молекул. У
процесі згортання крові фiбриноген перетворюється у фiбрин. На вiдмiну вiд
фiбриногену фiбрин не розчиняється у воді i володіє значно більшою
молекулярною масою.
Прицип: При добавленні до плазми кровi натрію хлориду до концентрацiї
10% в осад випадає практично тільки фiбриноген, а всi iншi бiлки плазми
залишаються в розчинi.
Хід роботи: Точно вiдмiрюють пiпеткою i наливають в центрифужну
пробiрку 2 мл плазми кровi. Зважують 200 мг сухого натрій хлориду,
висипають в пробiрку з плазмою i старанно перемішують до повного
розчинення. Спостерiгають утворення осаду. Центрифужну пробiрку з
розчином урівноважують з центрифужною пробiркою, в яку наливають
дистильовану воду. Пробiрку центрифугують 15 хвилин при 3500 об/хв.
Супернатант зливають в стакан. Осад являє собою щiльну масу з добре
вираженою волокнистою структурою.
Робота 1.22. Кількісне визначення білка біуретовим методом
Принцип: В основі лежить кольорова реакція з біуретовим реактивом:
білки в лужному середовищі реагують із купрум сульфатом, при цьому
утворюються сполуки, забарвлені у фіолетовий колір.
Хід роботи. Для досліду беруть три пробірки. У першу (контрольну)
пробірку вносять 1 мл 0.9% розчину натрій хлориду, у другу (дослідну) – 0,1 мл
стандартного розчину білка (50 г/л), у третю (дослідну) пробірку – 0,1 мл
досліджуваної сироватки крові. В усі пробірки добавляють по 5 мл біуретового
реактиву, перемішують вміст пробірок. Через 30 хвилин визначають
екстинкцію ФЕК дослідних пробірок (кювета 10 мм, червоний світлофільтр 750
нм) проти контрольної пробірки.
Розрахунок проводять за формулою:
а • b
Х = , де
с
Х – концентрація білка в досліджуваній сироватці крові, г/л;
а – концентрація білка стандартного розчину білка;
24b – екстинкція досліджуваної сироватки крові ;
с – екстинкція стандартного розчину білка.
Кількісно загальний білок можна визначати в сироватці або плазмі
крові за допомогою тестового набору реактивів напіпатоматичним
біохімічним аналізатором “ State Fax 1904 plus “ та іншими.
Клініко-діагностичне значення
У здорової людини вміст білків становить 60- 85г/л. Зменшення вмісту
білків нижче 60 г/л - гіпопротеїнемія, а збільшення білків більше ніж 85 г/л -
гіперпротеїнемія.
Гіпопротеїнемію спостерігають при: нефротичному синдромі, ентериті,
хронічному панкреатиті, опіках, екземі, масивних крововтратах, хронічних
захворюваннях нирок, під час голодування, при сецевій декомпенсації.
Гіперпротеїнемію спостерігають при: магроглобулінемії Вальденстрема,
ревматоїдному артриті, колагенозах, цирозі печінки, згущенні крові ( при
діареї, блюванні, цукровому діабеті, важких травмах), гострих інфекійних
захворюваннях.
25РОЗДІЛ ІІ
ФЕРМЕНТИ. КОФЕРМЕНТИ. ВІТАМІНИ
А. Питання для підготовки з теоретичного матеріалу:
1.Поняття про ферменти, їх значення в процесах життєдіяльності, історія
ферментології.
2.Номенклатура та класифікація ферментів.
3.Поняття про активний та алостеричний центри ферментів. Алостеричний
ефект. Регуляторні ферменти.
4.Клітинна організація ферментів. Мембранозалежні ферменти.
5.Властивості ферментів як біокаталізаторів: специфічність дії,
термолабільність, залежність ферментативної активності від рН середовища.
6.Активатори та інгібітори ферментів. Типи гальмування ферментативних
реакцій. Застосування інгібіторів ферментів як лікарських препаратів в
медичній практиці.
7.Принципи визначення та одиниці ферментативної активності.
8.Хімічна природа та структура ферментів.
9.Поняття про коферменти, їх значення, класифікація коферментів.
10.Вітаміни-попередники коферментів, їх класифікація. Загальні поняття
вітамінології (вітаміни, антивітаміни, провітаміни, гіпо-, гіпер- та
авітамінози, вітаміноподібні речовини).
11.Коферменти І-ї групи (переносники електронів та протонів), їх
представники.
Характеристика вітамінів РР, В2, С як попередників вітамінних коферментів
цієї групи.
12.Коферменти ІІ-ї групи (переносники окремих хімічних груп), їх
представники
Характеристика вітамінів В1, В3, В6, В8, В9, та В12 як попередників
коферментів ІІ групи.
13.Жиророзчинні вітаміни, їх участь в обміні речовин.
14.Ізоферменти та мультиферментні комплекси. Клінічне значення визначення
ізоферментів у крові.
15.Механізм дії ферментів, поняття про енергетику та кінетику
ферментативних реакцій.
16.Види регуляції ферментативної активності.
17.Основні напрямки медичної ензимології: ензимопатологія,
ензимодіагностика, ензимотерапія.
18.Ферменти, інгібітори ферментів, коферменти, вітаміни як лікарські
препарати, їх клінічне застосування.
19.Принципи визначення активності ;-амілази та аскорбінової кислоти у сечі.
Б.Література:
1.Лекції, що читаються на кафедрі.
262.Л.М.Вороніна, В.Ф.Десенко, Н.М.Мадієвська. "Біологічна хімія", Харків,
2000.С:109-161, 426-463.
3.Е.А.Строев, “Биологическая химия”,Москва,1986.С.:122-163, 339-370.
4.Ю.І.Губський, “Біологічна хімія", Київ-Тернопіль, 2000. С.:86-115, 399-411.
5.Я.І.Гонський, Т.П.Максимчук, М.І.Калинський, ”Біохімія людини”,
Тернопіль ”Укрмедкнига”, 2002.С. 66-153.
В.Опис лабораторних робіт
Робота 2.1. Специфічність дії ферментів
Принцип. Амілаза(3.2.1.1.)слини прискорює гідроліз тільки полісахаридів
(крохмалю), не впливає на дисахариди. Сахараза (3.2.1.26.), що міститься в
дріжджовому екстракті, розщеплює тільки сахарозу. Продуктами гідролізу
полі- і дисахаридів є моносахариди, зокрема, глюкоза, яка може бути відкрита
реакцією Тромера. Позитивна реакція Тромера свідчить про повний гідроліз
крохмалю та сахарози під впливом відповідних ферментів. Позитивна реакція з
йодом вказує на відсутність гідролізу крохмалю.
Хід роботи. Взяти 4 пробірки. У першу та другу пробірки наливають по
5мл 1% розчину крохмалю, в третю і четверту пробірки доливають по 5 мл 2%
розчину сахарози. Потім у першу і третю пробірки додають по 1 мл слини, що
містить амілазу, в другу і четверту пробірки – по 1 мл дріжджового екстракту,
що містить фермент сахаразу. Вміст пробірок старанно перемішують і ставлять
у термостат на 20 хвилин при температурі 38-40°С.
Після закінчення цього строку вміст кожної пробірки ділять на дві частини:
з однією частиною проводять реакцiю на крохмаль (з йодом), з другою -
реакцiю Тромера на глюкозу (додають 10 крапель 10% розчину натрій
гідроксиду та 2-3 краплі 1% розчину купрум(ІІ) сульфату, нагрiвають).
Отриманi результати заносять в таблицю.
№ пробірок
Вміст пробірок Реакція
з йодом
(“+“
чи
“-“)
Реакція
Тромера
(“+“
чи
“-“)
Розчин
крохмалю,
мл
Розчин
сахарози,
Мл
Слина,
мл
(амілаза)
Екстракт
дріжджів,
мл
(сахараза)
1 5 - 1 -
2 5 - - 1
3 - 5 1 -
4 - 5 - 1
Робота 2.2. Залежнiсть ферментативної активностi вiд температури
Принцип. Температура, при якiй спостерiгається максимальна швидкiсть
ферментативної реакцiї, називається оптимальною i частіше дорівнює 37-40°С.
При підвищенні температури швидкiсть бiльшостi ферментативних процесiв
починає зменшуватись. Це пояснюється тепловою денатурацiєю білкової
молекули ферменту i втратою каталiтичної активностi.
27Хiд роботи. У двi пробiрки наливають по 1 мл 1% розчину крохмалю. В
одну з них вносять 0,2 мл звичайної, а в другу - прокип'яченої слини. Вмiст
перемiшують, ставлять в термостат при температурi 37°С на 10 хвилин. Потiм у
пробiрки вносять по 1 краплi розчину йоду. У пробiрцi з нерозщепленим
крохмалем з'являється синє забарвлення.
Робота 2.3. Вплив рН середовища на активнiсть ферментів
Принцип. Вплив рН на активнiсть ферментів пояснюється тим, що бiлкова
молекула ферменту є амфотерним полiелектролiтом i його каталiтична
активнiсть залежить вiд ступеня iонiзацiї функціональних груп, які входять в
його активний центр. Зміщення рН вiд оптимуму порушує зв'язок мiж бiлковою
частиною ферментiв та їх простетичними групами, що гальмує зв'язок
субстрату з ферментом. Робота полягає у дослідженні активностi амiлази слини
при рiзних значеннях рН.
Хiд роботи. У 3 пронумеровані пробiрки наливають по 5 мл 0,5% розчину
крохмалю та по 1 мл фосфатного буфера з вiдповiдним значенням рН: в першу
- з рН 5,6; в другу - з рН 6,8; в третю – з рН 8,1. У кожну пробiрку додають по
1мл слини, перемішують i ставлять в термостат при температурi 38
о
С. Через 20
хвилин у кожну пробiрку доливають 1-2 краплi йоду.
Результати записують у таблицю i роблять висновки.
№
пробірок
рН середовища Забарвлення
1 5,6 Синє
2 6,8 Жовте
3 8,1 Фіолетове
За результатами роботи вказують оптимум рН для амiлази слини.
Робота 2. 4. Вплив прозерину на гiдролiз ацетилхолiну холiнестеразою
(3.1.1.8)
Принцип. Гальмування дiї ферментiв може вiдбуватися в тому випадку,
якщо з активним центром ферменту замiсть специфiчного субстрату зв'язується
його структурний аналог. Таке явище називається конкурентним гальмуванням.
Прикладом конкурентного гальмування може бути вплив прозерину на гiдролiз
ацетилхолiну холiнестеразою. Холiнестераза - фермент, що розщеплює
ацетилхолiн (медiатор парасимпатичної нервової системи) на холiн i ацетатну
кислоту. Утворену ацетатну кислоту можна виявити індикатором -
бромтимоловим синiм (у кислому середовищi дає жовте забарвлення).
Конкурентне гальмування ферментативного гiдролiзу ацетилхолiну можна
викликати прозерином, який є структурним аналогом ацетилхолiну.
Хiд роботи. У двi пробiрки наливають по 2,5 мл сироватки кровi i по 8
крапель розчину бромтимолового синього. Потiм у першу пробiрку додають 2
краплi розчину прозерину. Вмiст пробiрок старанно перемiшують. У кожну
пробiрку додають по 8 крапель розчину ацетилхолiну, перемiшують,
28вiдмiчають забарвлення в обох пробiрках (воно повинно бути темно-зелене, в
обох пробiрках однакове). Потiм пробiрки залишають при кiмнатнiй
температурi на 1 годину. Пiд час дослiду можна спостерiгати, як поступово, в
мiру накопичення оцтової кiслоти в результатi гiдролiзу ацетилхолiну
забарвлення сумiшi в другiй пробiрцi переходить у зелене, а потiм у жовте, тодi
як гiдролiз у першiй пробiрцi, де був прозерин, практично не вiдбувається i
забарвлення сумiшi не змiнюється.
Робота 2. 5. Вплив активаторів та iнгiбiторiв на активнiсть амiлази
(3.2.1.1) слини
Принцип. Активатором амiлази є натрій хлорид (NaCl), iнгiбiтором –
купрум (ІІ) сульфат (CuSO4). Дiю цих речовин на активнiсть амiлази виявляють
за ступенем гiдролiзу крохмалю пiд впливом ферментiв у їх присутностi.
Хiд роботи: Беруть 3 пробiрки. У першу наливають 1 мл води, в другу –
1мл 1% розчину NaCl, в третю – 1 мл 1% розчину CuSO4. В усi пробiрки
додають по 1 мл слини. Вмiст перемiшують i додають по 0,5 мл 1% розчину
крохмалю, потiм знову перемiшують i залишають при кiмнатнiй температурi на
5 хвилин. Далi в усiх пробiрках проводять реакцiю з йодом i спостерiгають за
характером забарвлення. Для бiльшої наочності забарвлення в кожну пробiрку
доливають по 2-3 мл води. Результати роботи заносять в таблицю i роблять
висновки.
Вміст пробірок Пробірки
1 2 3
Вода
NaCl, 1% розчин
CuSO4, 1% розчин
Cлина (амілаза)
Крохмаль, 1% розчин
+
-
-
+
+
-
+
-
+
+
-
-
+
+
+
Забарвлення пiсля
додавання йоду
Висновки
Робота 2. 6. Кiлькiсне визначення активностi ;-амiлази (3.2.1.1) в сечi
за методом Вольгемута
Принцип. Метод кiлькiсного визначення активностi амiлази сечi за
методом Вольгемута полягає в тому, що знаходять найменший вмiст ферменту,
який повнiстю розщеплює всю кiлькiсть доданого крохмалю, потiм роблять
перерозрахунок на 1 мл сечi.
Хiд роботи. У 10 пробiрок наливають по 1 мл 0,85% розчину натрій
хлориду. В першу пробiрку наливають 1 мл дослiджуваної сечi, перемiшують,
1мл сумiшi переносять у 2 пробiрку, з другої пробірки 1 мл сумiші переносять
у 3-ю пробiрку i т.д. З десятої пробiрки 1 мл сумiшi виливають. У кожну
пробiрку наливають по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемiшують i ставлять
на 30 хвилин у термостат при температурi 38°С, пiсля чого додають у кожну
29пробiрку по 1 краплi розчину йоду. Враховують розведення сечi в останнiй
пробiрцi з жовтим забарвленням.
Приклад розрахунку: якщо остання пробiрка, в якiй з'явилось жовте
забарвлення, - третя, то розведення сечi в нiй дорiвнює 1:8. 1мл нерозведеної
сечi може розщепити в 8 раз бiльшу кiлькiсть крохмалю, тобто А = 2 х 8 = 16,
де 2 - кiлькiсть 0,1% розчину крохмалю в мл, що використовується в дослiдi.
Амiлазна активнiсть сечi в нормi коливається вiд 16 до 64 одиниць.
Робота 2. 7. Конкурентне гальмування малоновою кислотою
сукцинатдегiдрогенази (1.3.99.1) м'язiв
Принцип. У присутностi малонової кислоти знижується активнiсть
ферменту сукцинатдегiдрогенази.
Хiд роботи. У три пробiрки вносять по 2-3 мл м'язевої кашицi i додають: у
першу - 0,4 мл води, в другу - 0,2 мл 1% розчину малонової кислоти та 0,2 мл
води, в третю - 0,4 мл 1% розчину малонової кислоти. В усi три пробiрки
додають по 1мл 1% розчину янтарної кислоти, по 2-3 краплi 1% розчину
метиленового синього i пiсля перемiшування - по 3-4 краплi вазелiнового
масла. Пробiрки ставлять у термостат при температурi 38
о
С. Через 5-10 хвилин
пробiрки виймають i спостерiгають змiну забарвлення. Результати заносять у
таблицю, роблять висновки.
Вміст пробірок Пробірки
1 2 3
М'язева кашиця
Вода
Малонова кислота, 1% розчин
Янтарна кислота, 1% розчин
Метиленова синь, 1% розчин
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
Зміна забарвлення
Висновки
Робота 2.8. Визначення активностi ;-амiлази (3.2.1.1.) в сироватцi кровi
та сечi за методом Каравея
Принцип. ;-амiлаза розщеплює крохмаль з утворенням продуктiв, що не
дають кольорової реакцiї з йодом. Метод полягає в колориметричному
визначеннi залишку нерозщепленого крохмалю за ступенем iнтенсивностi його
реакцiї з йодом.
Хiд роботи. У двi колби ємкiстю 50 мл (дослiдну i контрольну) вносять по
2 мл розчину крохмалю. Дослiдну пробу нагрiвають при 37°С на протязi 5
хвилин, пiсля чого в неї доливають 0,1 мл сироватки кровi або профiльтрованої
сечi. Вмiст колби перемiшують i ставлять у термостат на 7,5 хвилин при 37°С.
Пiсля нагрiвання дослiдної колби в обидвi колби додають по 5 мл робочого
розчину йоду. Об'єм реактивiв у колбах доводять дистильованою водою до 50
30мл i негайно визначають екстинкцiю розчинiв на фотоелектроколориметрi при
червоному свiтлофiльтрi (довжина хвилi – 630 - 690нм) в кюветi товщиною
шару 1см (контроль - дистильована вода).
Розрахунок: активнiсть ;-амiлази виражають в мг крохмалю,
гiдролiзованого 1 мл бiологiчної рiдини за 1 годину iнкубацiї при 37
о
С.
Розрахунок проводять за формулою:
Е1 - Е2 Е1 - Е2
А = • 2 • 8 • 10 • К = • 160 • К, де
Е1 Е1
Е1 - екстинкцiя контрольної проби;
Е2 - екстинкцiя дослiдної проби;
2 - кiлькiсть мг крохмалю, введеного в дослiдну i контрольну проби;
8 - коефiцiєнт перерахунку на 1 годину iнкубацiї;
10 - коефiцiєнт перерахунку на 1мл бiологiчної рiдини;
К - коєфiцiєнт розведення бiологiчної рiдини.
Пробірка
Склад проби
Кількість Екстинкція
субстрату,
мл
Кількість
сироватки,
мл
Кількість робочого
розчину йоду, мл
1
2
2,0
2,0
-
0,1
5,0
5,0
Розрахунок
та
висновки
Нормальнi показники активностi ферменту: сироватка кровi - 12-32 мг,
сеча – 20 – 160 мг, дуоденальний вмiст – 6 – 16 мг крохмалю, гiдролiзованого
1 мл бiологiчної рiдини за 1 год. iнкубацiї при 37
о
С. Результати дослiду
заносять у таблицю.
Ультрамiкроварiант
Хiд визначення дослiдної та контрольної проб той же, що i при
мiкроварiантi, але об'єм усіх реактивів і досліджуваної біологічної рідини
зменшують у 5 разів. Визначення проводять у пробірках об`ємом 10 мл.
Активнiсть ;-амiлази виражають у мг крохмалю, гiдролiзованого 1 мл
бiологiчної рiдини за 1 годину iнкубацiї при 37
о
С. Активнiсть ;-амiлази
розраховують за формулою:
Е1 - Е2 Е1 - Е2
А = • 2 • 8 • 10 • К = • 160 • К, де
Е1 Е1
Е1 - екстинкцiя контрольної проби;
Е2 - екстинкцiя дослiдної проби;
2 - кiлькiсть мг крохмалю, введеного в дослiдну i контрольну проби;
8 - коефiцiєнт перерахунку на 1 год. інкубацiї;
10 - коефiцiєнт перерахунку на 1мл бiологiчної рiдини;
31К - коефiцiєнт розведення бiологiчної рiдини.
Робота 2.9. Вiдкриття дiї ферменту пепсину (3.4.4.1)
Принцип. Протеолiтичну активнiсть пепсину можна спостерiгати, додавши
до його пiдкисленого розчину невелику кiлькiсть фiбрину. Фiбрин,
нерозчинний у водi, пiд дiєю пепсину гiдролiзується до розчинених пептидiв,
що пiдтверджується бiуретовою реакцiю.
Хiд роботи. У три пробiрки наливають по 1 мл 0,2% розчину пепсину в
0,2% розчині хлоридної кислоти. В другу пробiрку додають 10% розчин натрiй
карбонату до лужної реакцiї середовища на лакмус, а вмiст третьої пробiрки
кип'ятять 1-2 хвилини, потім охолоджують. У кожну пробiрку додають
маленький шматочок фiбрину (величиною з просяне зернятко), пробiрки
ставлять у термостат на 30 хвилин при температурi 38
о
-40°С.
Пiсля цього вiдзначають змiни, якi пройшли з фiбрином (його розчинення).
Потiм проводять з вмiстом кожної пробiрки бiуретову реакцiю (див.роботу
1.9.), попередньо пiдлуживши вмiст першої пробiрки. Вiдзначають результати.
Робота 2.10. Вiдкриття дiї ферменту лiпази (3.1.1.3)
Принцип. Лiпазу можна виявити, додавши розчин ферменту до молока,
пiдлуженого розчином натрiй карбонату до блiдо-рожевого кольору по
фенолфталеїну. В присутностi лiпази проходить гiдролiтичне розщеплення
жиру молока на глiцерин та жирнi кислоти, реакцiя середовища зсувається у
кислу сторону, i рожеве забарвлення зникає.
Хiд роботи. У двi пробiрки наливають по 10 крапель молока. У першу
пробiрку додають 5 крапель витяжки з пiдшлункової залози або 3% розчин
панкреатину, що мiстить лiпазу. В другу пробiрку додають таку ж кiлькiсть
води. В обидвi пробiрки вносять по однiй краплi 1% розчину фенолфталеїну i
краплями 1% розчин натрiй карбонату до появи блiдо-рожевого забарвлення
(не можна добавляти надлишок розчину натрiй карбонату). Пробiрки ставлять
у термостат при температурi 38°С на 30 хвилин. Спостерiгають змiну
забарвлення.
Робота 2.11. Кількісне визначення активності пептидаз панкреатину
Принцип. Метод грунтується на здатності пептидаз гідролізувати пептидні
зв’язки, що призводить до зростання кількості вільних аміно- та карбоксильних
груп.
Після блокування аміногруп формаліном карбоксильні групи підвищують
кислотність середовища, приріст якого визначають шляхом титрування лугом
за методом Зеренсена в присутності індикатора фенолфталеїну.
Хід роботи. У дві пробірки додають по 5мл 6% розчину казеїну і по 2мл
фосфатного буфера з рН 7,6. В одну з пробірок додають 0,5г панкреатину,
старанно перемішують і ставлять в термостат при температурі 37
о
С разом з
контрольною пробіркою.
32Через 30 хв. пробірки виймають з бані, охолоджують. Їх вміст переливають
у колбочки для титрування. Додають у кожну по 2-3 краплі фенолфталеїну і
підлужують з піпетки 0,2М розчином натрій гідроксиду до утворення
слабкорожевого забарвлення (рН 8,3).
За такої рН кількість аміногруп у розчині дорівнює кількості карбоксильних
груп. Далі в обидві колбочки додають по 5 мл формолової суміші (рН 8,3).
Формалін зв’язує аміногрупи, а карбоксильні групи зсувають значення рН
розчину до кислих значень.
Розчин знебарвлюється. Обидві проби титрують з бюретки 0,02М розчином
натрію гідроксиду до утворення слабкорожевого забарвлення (рН 8,3) і
додають ще декілька крапель 0,02М розчину натрій гідроксиду до утворення
яскраво-червоного кольору (рН 9.1.).
Розрахунок. Вираховують різницю між даними титрування досліджуваного
і контрольного розчинів. Активність пептидаз виражають в умовних одиницях.
Одна умовна одиниця відповідає 1 мл 0,02М розчину натрій гідроксиду,
використаного на титрування дослідної проби.
Клініко-діагностичне значення визначення активності ферментів.
Амілаза /3.2.1.1./ гідролізує крохмаль і декстрини. В організмі вона переважно
синтезується в слинних і підшлунковій залозах, хоч її активність реєструється і
в печінці, нирках, кишках, легенях.
Підвищення активності амілази спостерігають при панкреатиті, перитоніті,
тромбозі судин, розриві маткової труби при позаматковій вагітності,
скороченні сфінктера Одді, внаслідок введення в організм морфіну, кодеїну,
АКТГ та кортизолу.
Підвищення активності амілази слинних залоз спостерігають при нирковій
недостатності, стоматиті, невралгії лицевого нерва, паркінсонізмі. Зниження
активності амілази спостерігають при психічних захворюваннях, які
супроводжуються збудженням або депресією, при анацидних порушеннях.
Пептидази - це група гідролітичних ферментів, які розщеплюють білки до
амінокислот. В організмі пептидази локалізовані як в окремих клітинах, так і
секретуються екзокринними залозами в травний тракт. Найбільш активні
пептидази підшлункової залози: трипсин, хімотрипсин, карбоксипептидаза.
У нормі активність пептидаз сироватки крові становить 0,2-1,7
мкмоль/мл/год. Збільшення вмісту пептидаз у сироватці крові та зростання їх
активності спостерігають, перш за все, під час розпаду окремих ділянок органів
і тканин. Це стосується, у першу чергу, гострого панкреатиту, виразкової
хвороби, обширних опіків, гострого гепатиту. При цих захворюваннях
активність пептидаз у сироватці крові може збільшуватись у десятки і сотні
разів. Зниження активності пептидаз можна спостерігати при емфіземі легенів,
цирозі печінки.
Робота 2.12. Якісні реакції на вітаміни
2.12.1.Реакція на вітамін А
33В пробірку вносять 2 краплі розчину вітаміну А та доливають 2 краплі
концентрованої сульфатної кислоти. З
’
являється фіолетове забарвлення, що
переходить в буре.
2.12.2.Реакція на вітамін В1
До 3 крапель 5% розчину вітаміну В1 (тіаміну) доливають 10 крапель 10%
розчину натрій гідроксиду та 2 краплі 5% розчину калій гексациано(ІІІ)ферату.
З
’
являється жовте забарвлення в результаті окислення тіаміну в тіохром, яке
при опромінюванні ультрафіолетовими променями дає синю флуоресценцію.
2.12.3. Реакція на вітамін В2
Принцип. Реакція заснована на властивості вітаміну В2 легко
відновлюватися. Розчин вітаміну В2, що володіє жовтим забарвленням, при
відновленні набуває спочатку рожевого кольору за рахунок утворення
родофлавіну, а потім знебарвлюється.
Хід роботи. В пробірку наливають 10 крапель розчину вітаміну В2, потім
доливають 5 крапель концентрованої хлоридної кислоти і опускають зернину
металевого цинку. Починається утворення пухирців водню. Рідина поступово
рожевіє, а потім знебарвлюється.
2.12.4. Реакція на вітамін В6
Принцип. Вітамін В6 з ферум(ІІІ)хлоридом утворює сполуку типу ферум
феноляту, яка забарвлена в червоний колір.
Хід роботи. До 5 крапель 1% розчину вітаміну В6 доливають 1 краплю 1%
розчину ферум(ІІІ)хлориду. З’являється червоне забарвлення.
2.12.5. Реакція на вітамін РР
В пробірку вносять 8 крапель розчину вітаміну РР, доливають 2 краплі 5%
розчину кристалогідрату купрум(ІІ) сульфату(CuSO4*5H2O)і нагрівають на
кип
’
ячій водяній бані. З’являється синій осад мідної солі нікотинової кислоти.
2.12.6. Реакція на вітамін С (аскорбінову кислоту)
Принцип. Аскорбінова кислота в лужному середовищі може відновлювати
калій гексаціано(ІІІ)ферату(червону кров’яну сіль-іК3[Fe(CN)6] ) до калій
гексаціано(ІІ)ферату (жовтої кров’яної солі - К4[Fe(CN)6] ); останній можна
відкрити, додаючи розчин ферум (ІІІ) хлориду. В кислому середовищі
утворюється берлінська блакить, яка випадає у вигляді темно-синього осаду.
4FeCI3 + 3К4[Fe(CN)6] Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCI
Берлінська
блакить
Хід роботи. До 5 крапель 1% розчину вітаміну С прибавляють 1 краплю
10% розчину натрій гідроксиду і 1 краплю 5% розчину калій
гексаціано(ІІІ)ферату, перемішують і доливають 3 краплі 10% розчину
34хлоридної кислоти, і 1 краплю 1% розчину ферум (ІІІ) хлориду. Випадає осад
берлінської блакиті.
35Робота 2.12.7. Йодна проба на аскорбінову кислоту
Принцип. Аскорбінова кислота відновлює молекулярний йод до
безбарвної йодводневої кислоти.
Хід роботи. В дві пробірки наливають по 10 крапель дистильованої води,
додають по 1-2 краплі 0,1% розчину йоду в калій йодиді. В першу пробірку
додають 10 крапель екстракту з шипшини, в другу таку ж кількість
дистильованої води. В першій пробірці розчин йоду знебарвлюється.
Робота 2.12.8. Виявлення вітаміну Е реакцією з ферум (Ш) хлоридом
Принцип. Спиртовий розчин альфа-токоферолу окиснюється ферум
хлоридом до токоферілхінону червоного кольору.
Хід роботи. В суху пробірку вливають 4-5 крапель 0,1% розчину
токоферолу, додають 0,5 мл 1% розчину ферум хлориду, перемішують,
нагрівають до появи червоного кольору.
Робота 2.12.9. Виявлення витаміну К реакцією з аніліном
Принцип. Спиртовий розчин 2-метил-1,4-нафтохінону за наявності аніліну
забарвлюється в червоний колір, що зумовлено утворенням 2-метил-3-
феніламіно-1,4-нафтохінону.
Хід роботи. В пробірку наливають 16 крапель 0,05% спиртового розчину
вікасолу і додають 2 краплі 0,05% розчину аніліну, струшують. Рідина
забарвлюється в червоний колір.
Робота 2.13. Кількісне визначення аскорбінової кислоти
Принцип. Метод кількісного визначення аскорбінової кислоти заснований
на її здатності окислюватися в дегідроаскорбінову кислоту і відновлювати 2,6-
діхлорфеноліндофенол, який при відновленні забарвлюється.
2.13.1. Визначення аскорбінової кислоти в сечі
Хід роботи. В колбочку наливають 10 мл сечі, 10мл води і 16 крапель
концентрованої ацетатної кислоти. Титрують 0,001М розчином індикатору 2,6-
діхлорфеноліндофенолу до рожевого забарвлення, яке не зникає на протязі 30
секунд.
Проводять розрахунок аскорбінової кислоти в добовій сечі, беручи до
уваги, що 1 мл 0,001М розчину індикатору відповідає 0,088 мг аскорбінової
кислоти.
2.13.2. Визначення аскорбінової кислоти в молоці
Хід роботи. В колбочку наливають 5 мл розведеного в 3 рази молока,
додають 16 крапель 2% розчину хлоридної кислоти і 10 мл води. Вміст
титрують 0,001М розчином індикатору 2,6-діхлорфеноліндофенолу до
рожевого забарвлення. Розрахунок аскорбінової кислоти (Х) проводять за
формулою:
В • 3 • 0,088 • 100
36 Х = мг % , де
5
В –об’єм індикатору в мл, що пішов на титрування ;
3 - розведення молока;
0,088 - титр індикатору 2,6-дихлорфеноліндофенолу;
100 - перерахунок на 100мл молока;
5 - об’єм молока в мл, взята для титрування.
В нормі добове виділення аскорбінової кислоти із сечею 20-30мг.
Концентрація аскорбінової кислоти в молоці корови біля 1мг%.
Клініко-діагностичне значення
При деяких захворюваннях органів травної системи (виразкова хвороба,
гастрит, ентерит, холецистит тощо) порушується всмоктування вітамінів через
стінку кишок у кров і посилюється процес розпаду вітамінів у травному тракті.
Внаслідок цього можуть виникнути гіповітамінози, тобто недостатня вітамінна
забезпеченість організму.
Для оцінки С-вітамінної забезпеченості організму в клінічній практиці
визначають вміст вітаміну С у крові та сечі. В нормі в крові дорослої людини
вміст вітаміну С становить 39,7 – 113,6 мкмоль/л. У здорової людини за добу із
сечею виводиться 20 – 30 мг або 113,55 – 170,33 мкмоль вітаміну С.
Авітаміноз С призводить до виникнення такого захворювання , як цинга,
що супроводжується ціанозом губ, нігтів, кровоточивістю ясен, блідістю і
сухістю шкіри, точковими підшкірними крововиливами, розгойдуванням і
випаданням зубів, болем у суглобах, повільним загоєнням ран.
Робота 2.13.3 Визначення вітаміну С в харчових продуктах
(шипшині).
Хід роботи. Зважують 1 г шипшини. Наважку старанно подрібнюють
ножицями і розтирають у фарфоровій ступці з кварцевим піском. До розтертої
маси додають 9 мл 2% розчину хлоридної кислоти. Відстоюють 10 хв. Вміст
переміщують декілька разів і фільтрують. Для кількісного визначення беруть
3мл витяжки, поміщають її в конічну колбу і титрують 0,001М розчином 2,6-
дихлорфеноліндофенолу до появи рожевого забарвлення, яке не зникає на
протязі 30 секунд.
Розрахунок. Кількість вітаміну С (у відсотках) розраховують за формулою:
а • 0,088 • 10 • 100
Х = , де:
3 • 1
а – об’єм індикатору, що пішов на титрування, мл;
0,088 - кількість аскорбінової кислоти, відповідна 1мл 0,001М розчину
натрієвої солі 2,6-дихлорфенолуіндофенолу, г;
10 - об’єм фільтрату, мл ;
100 - коефіцієнт для перерахунку відсотки;
3 – об`єм витяжки для титрування, мл ;
1 - наважка харчового продукту, г.
3738Робота 2.14. Кількісне визначення рутину (вітаміну Р) в чаї
Принцип. Визначення основане на здатності рутину окислюватися калій
перманганатом. В ролі індикатору застосовується індигокармін, який вступає в
реакцію з калій перманганатом після того, як окислюється весь рутин.
Експериментально встановлено, що 1мл розчину калій перманганату
(Сн=0,05моль/л) окислює 3,2 мкг рутину.
Хід роботи. До 0,1 г чаю доливають 50мл гарячої води і проводять
екстракцію 5 хв.; 10 мл екстракту чаю відмірюють в колбочку, доливають 10 мл
дистильованої води і 10 крапель індикатору індигокарміну, титрують
розчином калій перманганатом (Сн=0.05 моль/л) до появи стійкого жовтого
забарвлення. Розрахунок проводять за формулою:
3,2 • А • 50 • 100
Х= , мг %, де
10 • 0,1 • 100
3,2 – маса рутину в мкг, яка відповідає 1мл розчину калій перманганату(Сн
=0,05 моль/л);
А - об’єм розчину калій перманганату(Сн = 0,05 моль/л), що пішов на
титрування;
50 – загальний об’єм витяжки, мл;
100 - перерахунок на 100 г чаю;
10 - об’єм екстракту, що взятий для титрування, мл;
0,1 – маса речовини в г , що взята для аналізу;
1000- перерахунок в мг.
В нормі в чаї міститься 30-50 мг% рутину.
Робота 2.15 Визначення стійкості вітаміну С при нагріванні в різних
умовах
Принцип. Вітамін С легко руйнується при нагріванні. Для вияснення
умов, що сприяють або гальмують окислення (руйнування), спостерігають
результати дії високої температури на вітамін С в присутності різних речовин.
Хід роботи. В три колбочки відміряють по 5 мл настою шипшини (або
по 10 мл настою хвої). Потім доливають в першу колбочку 5 мл 1М розчину
НСІ, в другу - 10 крапель 3% Н2О2,в третю - 0,5 мл 10% розчину CuSO4 . Всі
колбочки кип’ятять на електричній плитці на протязі 2 хв. Після охолодження
в першу, другу і третю колбочки доливають по 5 мл 1М НСІ і по 20 крапель
крохмалю в кожну пробу. Титрують кожну пробу розчином йоду з
Сн=0,01моль до стійкого на протязі 30 секунд синього, або бурого кольору.
Порівнюють цифри титрування після нагрівання в різних умовах з
вихідними цифрами титрування настою шипшини або хвої. Роблять висновки,
при яких умовах вітамін С зберігається в найбільшому ступені. Отримані
результати записують в протокол у вигляді наступної таблиці:
39Стійкість вітаміну С при нагріванні в різних умовах.
Умови нагрівання
НСl Н2О2 CuSO4
Об’єм в мл 0,01М розчину йоду, що
пішло на титрування.
Висновки:
Г. Контрольні питання з теми
”Ферменти, коферменти, вітаміни”
1.Історія розвитку ферментології та значення ферментів у процесах
життєдіяльності.
2.Номенклатура та класифікація ферментів.
3.Властивості ферментів як біокаталізаторів, умови їх дії.
4.Хімічна природа та структура ферментів.
5.Центри ферментів. Регуляторні ферменти.
6.Клітинна організація ферментів. Мембранозалежні ферменти.
7.Активатори та інгібітори ферментів.
8.Типи гальмування ферментативних реакцій. Застосування інгібіторів
ферментів в медичній практиці.
9.Принципи визначення та одиниці ферментативної активності.
10.Поняття про коферменти, їх значення і класифікації.
11.Вітаміни - попередники коферментів, їх класифікація.
12.Загальні поняття вітамінології (вітаміни, антивітаміни, провітаміни, гіпо-,
гіпер-, та авітамінози, вітаміноподібні речовини).
13.Будова та механізм дії коферментів: переносників електронів і протонів та
окремих хімічних груп.
14.Характеристика водорозчинних вітамінів як попередників вітамінних
коферментів.
15.Характеристика жиророзчинних вітамінів (А,D,E,К). Їх участь в обміні
речовин та коферментні функції.
16.Ізоферменти, клінічне значення визначення спектру ізоферментів в крові.
17.Мультиферментні комплекси , їх значення, приклади.
18.Види регуляції ферментативної активності.
19.Механізм дії ферментів, поняття про кінетику та енергетику
ферментативних реакцій.
20.Основні напрямки медичної ензимології: ензимопатологія,
ензимодіагностика., ензимотерапія.
21.Ферменти, коферменти, вітаміни - як лікарські препарати.
22.У чому полягають принципи визначення активності ;-амілази та вітаміну С
у сечі?
40РОЗДІЛ ІІІ
БІОЛОГІЧНЕ ОКИСНЕННЯ. МЕТАБОЛІЗМ КСЕНОБІОТИКІВ ТА
МІКРОСОМАЛЬНЕ ОКИСНЕННЯ
А.Питання для пiдготовки з теоретичного матерiалу:
1.Поняття про обмін речовин в організмі гетеротрофів.
2.Поняття про обмін енергії в організмі гетеротрофів.
3.Центральні метаболічні шляхи проміжного (внутрішньоклітинного) обміну.
4.Центральні метаболіти та стадії катаболізму, що дають енергію.
5.Цикл трикарбонових кислот Кребса (ЦТК) - визначення, локалізація,
значення. Хімізм.
6.Енергетичний баланс та регуляція ЦТК.
7.Історія розвитку вчення про біологічне окиснення (роботи М.О.Баха,
В.І.Палладіна та ін.).
8.Сучасні уявлення про біологічне окиснення. Ферменти та коферменти
дихального ланцюга. Структура комплексів дихального ланцюга (І, ІІ, ІІІ,
ІV), їх склад та значення. Редокспотенціал, його значення .
9.Утворення Н2О2 та СО2 в тканинах. Допоміжні ферменти тканинного
дихання.
10.Інгібітори тканинного дихання.
11.Окисне фосфорилювання. Основні положення хеміоосмотичної теорії
Мітчелла. Генерація ;µН
+
.
12.Коефіцієнт окисного фосфорилювання Р/О, та його значення. Макроергічні
сполуки. Будова АТФ та її значення.
13.Роз’єднувачі окисного фосфорилювання та тканинного дихання. Патологія.
14.Уявлення про ксенобіотики, мікросомальне окиснення та фармакокінетику.
15.Шляхи введення, механізм абсорбції, розподіл лікарських речовин в
організмі, шляхи введення.
16.Доля ксенобіотиків в організмі, види локалізації біотрансформації
лікарських речовин в організмі.
17.Мікросомальні електронотранспортні ланцюги. Характери-тика та значення
цитохрому Р-450, індукція монооксиге-наз.
18.Реакції катаболізму ксенобіотиків: кон’югації, гідроліз, гідроксилювання,
деалкілування.
19.Вплив екзогенних та ендогенних факторів на метаболізм лікарських
речовин.
20.Шляхи обміну етанолу, окиснення до кінцевих продуктів. Механізм
біологічної дії етанолу (реакції взаємодії ацетальдегіду з різними
речовинами і значення утворених продуктів). Ендогенний етанол та його
значення.
21.Принципи методу визначення АТФ, каталази, пероксидази.
Б.Література:
411.Л.М.Вороніна «Біологічна хімія»,Харків,2000.С.172-224, 257-265.
2.Ю.І. Губський «Біологічна хімія»,Київ-Тернопіль, 2000.С. 115-143.
3.Е.А.Строев «Биологическая химия»,Москва,1986.С. 115-122, 190-193.
4.Я.І.Гонський та співавтори ”Біохімія людини”, Тернопіль, 2002, С. 244-
255, 257-286, 311-319.
4.Лекції , що читаються на кафедрі.
В. Опис лабораторних робiт
Робота 3.1. Кількісне визначення АТФ в біологічних рідинах
Принцип. АТФ-аденозинтрифосфорна кислота – основна макроергічна
сполука організму, яка синтезується в мітохондріях в процесі окислювального
фосфорилювання. Значна кількість АТФ міститься в еритроцитах (в нормі 0,9-
1,5 мМ/л фільтрату еритроцитів).
Кількісне визначення АТФ проводять фотоколориметрично по збільшенню
неорганічного фосфату (Н3РО4) після 7 хвилинного гідролізу з 1М НСІ за
кольоровою реакцією з амоній молібдатом, в присутності відновлювача
аскорбінової кислоти, при ;=590 нм (червоний світлофільтр), в кюветі 0,3см ,
проти дистильованої води. Гідроліз АТФ відбувається за схемою:
Хід роботи.
1 - Визначення неорганічного фосфату у фільтраті еритроцитів до гідролізу.
В пробірку №1 вносять 0,5 мл фільтрату еритроцитів, додають 1 мл
дистильованої води, 0,25 мл 2,5% розчину амоній молібдату та 0,25 мл
свіжовиготовленного 1% розчину аскорбінової кислоти. Після 5 хв. інкубації
пробу фотометрують при довжині хвилі 590 нм в кюветі 0,3 см проти
дистильованої води. Концентрацію (С1) знаходять за калібрувальним графіком.
2 - Визначення неорганічного фосфату у фільтраті еритроцитів після
гідролізу.
В пробірку №2 вносять 0,5 мл фільтрату еритроцитів, додають 1 мл
дистильованої води та 7 крапель 1М розчину НСІ .Проводять кислотний
гідроліз – пробу кип’ятять на водяній бані рівно 7 хвилин, після чого додають
0,25 мл 2,5% розчину амонію молібдату та 0,25 мл 1% розчину аскорбінової
кислоти і після 5 хвилинної інкубації знову фотометрують. Концентрацію (С2)
знаходять за калібрувальним графіком.
Розрахунок. Кількість АТФ у фільтраті еритроцитів розраховується по
формулі:
(С2 – С1) • 0,5 • 2000
Х = , де
2 • 10 • 1000
С2- маса АТФ у фільтраті еритроцитів, знайдена за калібрувальним
графіком (після гідролізу) в мкм;
С1- маса АТФ у фільтраті еритроцитів, знайдена за калібрувальним
графіком (до гідролізу);
422- коефіцієнт перерахунку неорганічного фосфату в АТФ;
10, 1000, 2000- коефіцієнти переводу в мМ;
0,5- об’єм фільтрату еритроцитів.
В нормі 1л фільтрату еритроцитів містить 0,9-1,5 ммоль АТФ.
Клініко-діагностичне значення
Відомо, що концентрація АТФ збільшується в фільтраті еритроцитів при
гіпоксії, а знижується при спадкових гемолітичних анеміях.
Робота 3.2. Кiлькiсне визначення активностi каталази (1.11.1.6) кровi
(за методом Баха i Зубкової)
Принцип. Фермент каталаза мiститься у великiй кiлькостi в еритроцитах, а
також в усiх тканинах i рiдинах органiзму. Бiологiчна роль каталази полягає в
знешкодженнi гідроген пероксиду (Н2О2) шляхом його розпаду на
молекулярний кисень i воду:
каталаза
2Н2О2 О2 + 2Н2О
Активнiсть каталази виражають за допомогою числа i показника
каталази. Каталазним числом називають кiлькiсть мг гідроген пероксиду, яка
розкладається одним мкл кровi за певний промiжок часу. Про кiлькiсть
розкладеного гідроген пероксиду судять по рiзниці кiлькостi калiй
перманганату, яка пiшла на титрування контрольної та дослідної проб.
Показником каталази називають вiдношення каталазного числа до числа
мiльйонiв еритроцитів в мкл дослiджуваної кровi.
Хiд роботи. Готують лаборанти: у мiрну колбу на 100 мл наливають 10 мл
дистильованої води, туди ж вносять мiкропiпеткою 0,1 мл кровi. Пiпетку
промивають декiлька разiв тим же розчином. Воду додають у колбу до мiтки та
отримують основний розчин кровi (1:1000), який використовується для
визначення каталазного числа.
Виконують студенти: у двi колби для титрування наливають по 7 мл
води i додають по 1мл основного розчину кровi. У кожну колбу вносять точно
по 2 мл 1% розчину гідроген пероксиду . У контрольну колбочку вносять 3 мл
10% розчину сульфатної кислоти для розкладання каталази. Обидвi колби
залишають при кiмнатнiй температурi на 30 хвилин. Потiм у дослiдну колбу
доливають 3 мл 10% розчину сульфатної кислоти для розкладання каталази.
Обидвi колби залишають при кiмнатнiй температурi на 30 хвилин. Потiм у
дослiдну колбу наливають 3мл 10% розчину сульфатної кислоти та
вiдтитровують вмiст обох колб 0,1М розчином калiй перманганату до появи
рожевого забарвлення. Рiзницю мiж результатами дослiду i контролю множать
на 1,7 i отримують каталазне число кровi.
Приклад розрахунку: моль-еквiвалент Н2О2 рiвний 17г. Отже, в 1 мл
0,1М розчину мiститься 1,7 мг Н2О2; перемноживши 1,7 на рiзницю мiж
кiлькiстю мл 0,1М розчину калiй перманганату, що пiшов на титрування
вмiсту контрольної i дослiдної колб, отримують кiлькiсть мг гідроген
пероксиду, яке розкладається 1мкл дослiджуваної кровi, тобто отримують
43одразу каталазне число. В нормi каталазне число коливається вiд 10 до 15
одиниць.
44Клініко-діагностичне значення
При кiлькiсному визначеннi активностi каталази необхiдно порiвнювати
показники каталази, а не каталазнi числа, тому що фермент мiститься майже
виключно в еритроцитах. Вмiст каталази в кровi знижується при рядi
захворювань, таких як: рак, анемiя, туберкульоз та iншi.
Робота 3.3. Визначення активностi пероксидази (1.11. 1.7.) кровi
Принцип. Пероксидаза мiститься в усiх рослинних клiтинах. Гемоглобiну,
мiоглобiну i цитохромам також властива слабка пероксидазна активнiсть.
Пероксидаза перетворює гідроген пероксид на воду i атомарний кисень:
пероксидаза
2Н2О2 2О + 2Н2О
Хiд роботи. У пробiрку вносять 2 мл ацетатного буфера, 3мл розведеної
кровi (1:1000), 2 мл дистильованої води i 8 крапель з Сн= 0,001 моль/екв
розчину індигокарміну. Потiм додають 2 мл 0,2 моль/екв розчину гідроген
пероксиду i перемiшують. Час додавання розчину гідроген пероксиду
фiксують як початок реакцiї вмиканням секундомiру. Реакцiю вважають
завершеною, як тiльки синє забарвлення iндигокармiну перейде в жовте. В
нормi пероксидазна активнiсть кровi коливається мiж 30-50 секунд.
Робота 3.4. Спiвставлення редокспотенцiалу рибофлавiну та
метиленової синi
Напрямок та послiдовнiсть переносу електронiв залежать вiд величини
редокспотенцiалу. Редокспотенцiал (РОП) - це електричний заряд, що виникає
на платинових електродах, занурених у розчин окисненої та вiдновленої форми
однієї і тієї ж речовини. Речовини з бiльшим РОП окиснюють речовину з
меншим РОП, тобто транспорт електронiв вiдбувається вiд меншого
потенцiалу до бiльшого. Таким чином, порядок переносу гідрогену
ферментними системами в дихальному ланцюгу не випадковий. Вiн
обумовлений величиною РОП їх коферментiв.
Принцип. Вiдновлення метиленової синi гідрогеном, який добувають
взаємодією цинку з хлоридною кислотою, вiдбувається ранiше, нiж
вiдновлення рибофлавiну, тому що її РОП (Ео = +0,11В) бiльше, нiж у
рибофлавiну (Ео = -0,02В). При вiдсутностi гідрогену спочатку окиснюється
вiдновлений рибофлавiн, а потiм починається окиснення лейкометиленової
синi.
Хiд роботи. У пробiрку вносять 4-6 крапель дистильованої води, 2 краплi
рибофлавiну i по краплях розчин метиленової синi до синього або зеленувато-
синього забарвлення розчину. Потiм у пробiрку вносять шматочок цинку i
краплю концентрованої хлоридної кислоти. При цьому починається видiлення
пухирцiв гідрогену. По мiрi насичення розчину гідрогеном, РОП постiйно
знижується, i вiдбувається вiдновлення рибофлавiну i метиленової синi. Але
45вiдновлення метиленової синi (Ео = +0,11В) вiдбувається ранiше, нiж
вiдновлення значної частини внесеного в пробiрку рибофлавiну (Ео = -0,02В),
тому колiр рiдини поступово переходить в зелений, жовто-зелений, жовтий,
безбарвний. Жовтий колiр рибофлавiну при його вiдновленнi змiнюється
спочатку на рожевий: утворюється промiжний продукт вiдновлення -
родофлавiн. Пiсля вiдновлення рибофлавiну розчин знебарвлюється. Безбарвну
рiдину зливають в iншу пробiрку i спостерiгають перехiд забарвлення в жовто-
зелене, синє.
Гідроген у рiдину бiльше не поступає, а розчинений гідроген
переноситься через рибофлавiн та метиленову синь на кисень повiтря. Пiсля
втрати гідрогену починається окиснення вiдновленого рибофлавiну; вiн
передає свiй гідроген через iндикатор - метиленову синь на оксиген i жовтiє
(частина гідрогену поступає на оксиген, обминаючи iндикатор). Пiсля цього
починається окиснення лейкоформи метиленової синi - розчин стає спочатку
зеленим, потiм синiм.
Робота 3.5. Визначення активностi сукцинатдегiдрогенази (1.3.99.1)
Принцип. Сукцинатдегiдрогеназа каталiзує дегiдрування янтарної кислоти
(сукцинату), при якому остання перетворюється на фумарову кислоту, а
сукцинатдегiдрогеназа вiдновлюється. При додаванні в середовище окисненої
форми метиленової синi вiдновлена сукцинатдегiдрогеназа передає гідроген на
метиленову синь, яка переходить в лейкосполуку. Критерiєм активностi
сукцинатдегiдрогенази є час знебарвлення метиленової синi в присутностi
янтарної кислоти в анаееробних умовах.
Хiд роботи. У фарфоровiй ступцi розтирають 1 г тканини печiнки щура з
20 мл дистильованої води для отримання гомогенату. Потiм у 2 пробiрки
(дослiдну i контрольну) помiщають по 2 мл отриманого гомогенату. В обидвi
пробiрки наливають по 1 мл фосфатного буфера (рН=6,8), по 2 мл
нейтралiзованого розчину янтарної кислоти ( з Сн=0,01М) i додають по 2 краплi
0,05% розчину метиленової синi. У контрольну пробiрку додають 5 крапель
концентрованої хлоридної кислоти. Вмiст обох пробiрок перемiшують i
заливають пiдiгрiтим агар-агаром на висоту приблизно 1 см. Пробiрки
помiщають в стаканчики з кригою для застигання агар-агару. Потiм пробiрки
ставлять в термостат при температурi 37°С. Дослiд вважають закiнченим, якщо
в дослiднiй пробiрцi рiдина буде майже безбарвна. У контрольнiй пробiрцi
рiдина не змiнює забарвлення, бо фермент, при додаваннi хлоридної кислоти,
денатурується і не відновлює метиленову синь.
Работа 3.6. Кількісне визначення пірувату (піровиноградної кислоти) в
біологічних рідинах
Принцип. Піровиноградна кислота (ПВК) є одним з центральних
метаболітів обміну речовин. Для кількісного визначення ПВК
використовується кольорова реакція з 2,4-дінітрофенілгідразином. В результаті
взаємодії утворюється продукт червоного кольору. Інтенсивність забарвлення
46пропорційна вмісту ПВК в дослідній пробі і визначається фотоколориметрично
на ФЕК при ;=490 нм, в кюветі 0,5 см проти контролю.
Хід роботи. Для дослідження беруть дві пробірки (дослідну і контрольну).
В дослідну пробірку вносять 0,2 мл досліджуваної біологічної рідини, 0,1 мл
0,2% розчину 2,4-дінітрофенілгідразину. В контрольну – 0,2 мл дистильованої
води і 0,1 мл 0,2% розчину 2,4-дінітрофенілгідразину. Проби залишають на 20
хвилин при кімнатній температурі. Потім в обидві пробірки наливають по 0,5
мл 5% розчину натрій гідроксиду. Повторно залишають пробірки на 15 хвилин
при кімнатній температурі, після чого добавляють по 1,8 мл дистильованої
води. Проби фотоколориметрують.
Розрахунок проводять за формулою:
С = 46 • ;D (мкМ/л), де
;D – екстинкція ФЕКа;
46 – коефіцієнт перерахунку.
Клініко-діагностичне значення
В крові здорової людини міститься 45-115 мкМ/л піровиноградної кислоти,
із сечею за добу її виділяється 15-25 мг.
Вміст ПВК підвищується в крові при В1-вітамінній недостатності,
захворюваннях печіни, інсулінзалежному цукровому діабеті, респіраторному
алкалозі, гіперфункції гіпофізарно-адреналової та симпатико-адреналової
систем. Крім того, вміст ПВК різко підвищується в спиномозковій рідині при
травмах ЦНС і запальних процесах мозку (менінгіт, абсцес).
Робота 3.7. Виявлення метаболiтiв анiлiну в сечi
Виявлення ксенобiотикiв та продуктів їх обмiну в кровi, сечi та iнших
бiологiчних рiдинах має важливе значення, тому що свідчить про надходження
ксенобіотиків у внутрiшнє середовище органiзму людини та про можливiсть їх
токсичної дiї. Анiлiн, що потрапив у органiзм людини або тварини,
гiдроксилюється в параамiнофенол при участi цитохрому Р-450.
анiлiн n - амiнофенол
Принцип. Робота заснована на утвореннi забарвленого в синiй колiр
iндофенолу при взаємодії параамiнофенолу з фенолом у присутностi окисника.
47Хiд роботи. Беруть дві пробірки, в дослідну вносять 1 мл сечi, а в
контрольну – 1 мл дистильованої води. В обидві пробірки послідовно додають:
0,5 мл 10% розчину натрiй карбонату, 1 мл свiжовиготовленого розчину
фенолу (2% розчин на 0,2М розчинi натрій гідроксиду) i 0,1 мл 1% розчину
калій гексациано (ІІІ) ферату (червоної кров’яної солі).
Проби фотоколориметрують при червоному свiтлофiльтрі в кюветi
0,5см. Розрахунок роблять за пропорцією, виходячи з того, що 0,1мкМоль
параамiнофенолу вiдповiдає 0,29 одиницям оптичної густини.
Пiдрахувавши кiлькiсть параамiнофенолу, який видiлила людина за
добу з сечею, можна визначити, скiльки анiлiну проникло в органiзм.
Клініко-діагностичне значення
Виявлення параамiнофенолу в сечi людини, яка перебуває на хiмiчному
виробництвi, свiдчить про те, що анiлiн потрапив в органiзм людини, i про
недостатнiсть засобiв охорони працi на цьому пiдприємствi.
Робота 3.8. Визначення здатностi органiзму людини до окисного
деалкiлювання ксенобiотикiв (амiдопiриновий тест)
Принцип. Здатнiсть органiзму до перетворення ксенобiотикiв можна
вивчати на прикладi амiдопiрину. Амiдопiрин в органiзмi людини пiддається
окисному деметилюванню з утворенням 4-амiноантипiрину (4-ААП) за участю
цитохрому Р-450 згiдно схеми реакції:
Амiдопiрин 4-амiноантипiрин
Визначивши в сечi кiлькiсть 4-амiноантипiрину, можна вирахувати частину
амiдопiрину, що перетворюється в метаболiт 4-амiноантипiрин. Звичайна тест-
48доза амiдопiрину – 250 мг (1000 мкМоль). У людини, яка її прийняла, з сечею
видiляється 15-30 % продукту - 4-амiноантипiрину.
Хiд роботи. Беруть дві пробірки: в дослідну додають 1 мл сечi, 0,5 мл 2,5%
розчину амонiй гiдроксиду, 2 мл 0,02% розчину фенолу та 0,5 мл 1% розчину
калiй гексациано (ІІІ) ферату. Контрольну пробу готують так, як i дослiдну, але
замiсть розчину фенолу додають 2 мл дистильованої води.
Проби фотометрують в кюветi 1 см при зеленому свiтлофiльтрi проти
контролю. Розрахунок кiлькостi 4-амiноантипiрину здiйснюють, виходячи з
того, що 0,5мкмоль 4-амiноантипiрину вiдповiдає 0,7 одиницям оптичної
густини.
Приклад розрахунку : хворий прийняв 250 мг (1000 мкМоль) амiдопiрину.
Об
,
єм сечi, зiбраної за добу, дорiвнює 1350 мл. Фотоколориметруванням
встановлена екстинкція – 0,5.
1. 0,5 мкМ 4-ААП - 0,70 показник екстинкції
Х - 0,50 показник екстинкції досліду
тоді Х = 0,357 мкМоль 4-ААП в 1 мл сечi,
2. 0,357 • 1350=482 мкМ за добу
3. 1000 мкМоль - 100 %
482 мкМоль - Х Х = 48,2%
Висновок: 48,2 % введеного амідопірину перетворилося в 4-
аміноантипірин.
Клініко-діагностичне значення
При порушеннi функцiї печiнки спостерiгається сповiльнення перетворення
амiдопiрину в 4-амiноантипiрин.
Якщо ж людина тривалий час приймає лiки або зловживає алкоголем, то
швидкiсть деметилювання амiдопiрину може пiдвищуватися.
Г. Контрольні питання з теми:
”Біологічне окиснення. Метаболізм ксенобіотиків. Мікросомальне
окиснення”
1.Обмін речовин в організмі гетеротрофів: катаболізм, анаболізм,
внутрішньоклітинний обмін, амфіболічні процеси.
2.Біоенергетика. Уявлення про обмін енергії.
3.Центральні метаболічні шляхи проміжного (внутрішньоклітинного) обміну.
4.Етапи катаболізму та вивільнення енергії з органічних речовин. Значення
центральних метаболітів.
5.Окисне декарбоксилювання пірувату. Структура мультиферментного
комплексу.
6.Цикл трикарбонових кислот Кребса: механізм, ферменти та коферменти
процесу.
7.Енергетичний баланс, значення, регуляція та поповнення метаболітів циклу
Кребса.
498.Поняття про біологічне окиснення. Історія розвитку вчення про біологічне
окиснення (роботи О.М.Баха, В.І.Паладіна, Віланда, Варбурга,
В.О.Енгельгардта, Мітчелла).
9.Структура та біологічне значення мітохондрій.
10.Тканинне дихання: сучасні уявлення про тканинне дихання, ферменти та
коферменти дихального ланцюга.
11.Структура комплексів дихального ланцюга (І,ІІ,ІІІ,VІ),їх склад та значення.
12.Редокспотенціал, його значення в тканинному диханні.
13.Утворення Н2О2 та СО2 в тканинах. Допоміжні ферменти тканинного
дихання.
14.Інгібітори тканинного дихання.
15.Окисне фосфорилювання. Основні положення хеміоосмотичної теорії
Мітчелла.
16.Принципи накопичення енергії біомембранами: генерація ;µН
+
. Структура і
функціонування Н
+
АТФ-синтетази.
17.Коефіціент окисного фосфорилювання Р/О, та його значення. Макроергічні
сполуки. Будова АТФ та її значення.
18.Роз’єднувачі окисного фосфорилювання.
19.Човниковий механізм транспорту водню з цитоплазми в мітохондрії.
20.Поняття про ксенобіотики – чужорідні речовини. Значення ксенобіології для
фармації та медицини.
21.Основні шляхи перетворення ксенобіотиків в організмі.
22.Уявлення про фармакокінетику: шляхи введення, абсорбція, розподіл та
виведення лікарських речовин.
23.Біотрансформація лікарських речовин. Види метаболізму в залежності від
локалізації лікарських речовин в організмі.
24.Вплив екзогенних та ендогенних факторів на метаболізм лікарських
речовин.
25.Мікросомальне окиснення. Мікросомальні електронно-транспортні
ланцюги: будова і функціонування.
26.Цитохром Р-450: функції, значення, ізоформи та індукція.
27.Поняття про метаболічну активацію. Утворення електрофільних
метаболітів.
28.Реакції катаболізму ксенобіотиків: гідроксилювання, деалкілювання,
кон’югації, гідролізу.
29.Шляхи обміну етанолу, окиснення до кінцевих продуктів.
30.Механізм біологічної дії та токсичності етанолу (реакції взаємодії
ацетальдегіда з різними речовинами та значення продуктів, що утворилися).
Значення ендогенного етанолу.
31.У чому полягають принципи методів визначення АТФ, каталази та
пероксидази крові ?
50РОЗДІЛ ІV
ОБМІН АМІНОКИСЛОТ ТА ПРОСТИХ БІЛКІВ
А.Питання для підготовки з теоретичного матеріалу:
1.Значення бiлкiв для життєдiяльностi органiзму. Вміст білків в харчових
продуктах. Бiологiчна цiннiсть бiлкiв. Добова потреба людини в білках.
2.Азотистий баланс, його види Коефiцiєнт зношування.
3.Перетравлення бiлкiв в травному тракті (ентеральний обмін).
Перетравлення простих білків у шлунку, ферменти, роль НCl, муцину.
Кінцеві продукти травлення білків в шлунку.
4.Перетравлення білків в кишечнику. Протеолiтичнi ферменти
підшлункової залози та кишкового соку.
5.Кінцеві продукти травлення білків. Всмоктування амінокислот .
6.Гниття бiлкiв у товстій кишці. Знешкодження токсичних продуктiв
гниття. Клінічне значення визначення тваринного індикану.
7.Фармпрепарати, що регулюють ентеральний обмін.
8.Пул (фонд) амінокислот: шляхи його поповнення, та використання
амiнокислот в органiзмi.
9.Промiжний обмiн амiнокислот в органiзмi. Трансамінування: ферменти,
коферменти. Клiнiчне значення визначення трансамiназ в сироватцi
кровi.
10.Дезамінування: види, механізм, ферменти, коферменти, значення.
Непряме дезамінування. Роль глутамiнової та ;-кетоглутарової кислот в
азотистому обміні.
11.Декарбоксилювання амiнокислот. Утворення та біологічна роль
бiогенних амiнiв, їх знешкодження. Фармпрепарати – інгибітори МАО.
12.Джерела амiаку в органiзмi. Способи знешкодження та шляхи виведення
аміаку.
13.Сучасні уявлення про синтез сечовини, вмiст у кровi i добовiй сечi в
нормi та патологiї.
14.Поняття про глюконеогенез, глікогенні та кетогенні амінокислоти.
15.Особливостi обмiну та біологічне значення окремих амiнокислот
(глiцин, серин, цистеїн, метiонiн, аланін, треонін, аспартат, глутамат,
гiстидин, фенiлаланiн, тирозин, триптофан, аргінін, валін, лейцин,
ізолейцин).
16.Поняття про ферментнi блоки та молекулярні (спадкові) хвороби:
фенiлпiровиноградна олiгофренiя, кретинізм, алкаптонурiя, альбінізм,
хвороба кленового сиропу, амiноацидурiя та iншi.
17.Роль печiнки в бiлковому обмiнi. Гепатопротектори.
18.Бiохiмiчні показники стану бiлкового обмiну.
19.Принципи методів визначення: білка в сироватці крові та сечі, сечовини
в крові, активності трансаміназ, кислотності шлункового соку.
Б. Лiтература
1.Л.М.Вороніна, «Біологічна хімія», Харків, 2000. С. 341-348.
512.Ю.І.Губський. «Біологічна хімія», Киів-Тернопіль, 2000. С. 390-395,234-
263.
3.Е.А.Строев «Биологическая химия», Москва, 1986. С. 173,178-181, 274-
292.
4.Я.І.Гонський, Т.П.Максимчук, М.І.Калинський ”Біохімія людини”,
Тернопіль, ”Укрмедкнига”, 2002. С. 397-435.
5.Лекції, що читаються на кафедрі.
В. Опис лабораторних робiт
Робота 4.1. Визначення ступеню гiдролiзу бiлка методом формольного
титрування (по Серенсену)
В органiзмi в процесi перетравлювання постійно відбувається гiдролiз
бiлкiв. При гiдролiзi простих бiлкiв утворюються амiнокислоти. Гiдролiзати
бiлка (отриманi штучно шляхом нагрiвання з кислотою чи лугом) застосовують
у медицинi в ролi лiкарських препаратiв для парентерального харчування.
Метод формольного титрування дозволяє слiдкувати за ходом гiдролiзу бiлка,
вивчати дiю протеолiтичних ферментiв, а також визначати кiлькiсть бiлка,
наприклад, в молоцi.
Принцип. Кiлькiсть карбоксильних, отже i еквiвалентну їм кiлькiсть
амiногруп, визначають титруванням 0,1М розчином натрій гідроксиду в
присутностi формальдегiду; формальдегiд хiмiчно зв'язує амiногрупи, що
мають лужнi властивостi, в результатi чого розчин стає кислим (через наявнiсть
у амiнокислот i бiлкiв карбоксильних груп). Бiлковий гiдролiзат отримують
нагрiванням бiлка з сiрчаною кислотою (заздалегідь виконується
лаборантом).
Хiд роботи. Визначають азот амiногруп в 4-х пробах: 1) в розчинi бiлка
до гiдролiзу; 2) в гiдролiзатi бiлка, отриманого через 10 хвилин пiсля гiдролiзу;
3) в гiдролiзатi білка, отриманого через 40 хвилин; 4) в розчинi пiсля повного
гiдролiзу (1 годину). Для цього в колбочку наливають 5 мл відповідного
розчину, додають 3 мл 20% нейтрального розчину формаліну i 2-3 краплi 1%
розчину фенолфталеїну. Титрують з бюретки 0,1М розчином натрій гідроксиду
до утворення рожевого забарвлення.
Проводять розрахунок ступеню гiдролiзу, віднімаючи вiд кожного значення
титрування кількість мл натрій гідроксиду, що пішла на титрування розчину
білка до гiдролiзу (1-а проба).
Приклад розрахунку: на титрування 5 мл 1-ої проби пішло 0,2 мл 0,1М
розчину натрій гідроксиду, 2-ої проби – 1 мл, 3-ої проби – 2 мл, 4-ої проби –
4мл. Вiднiмаючи вiд кожного результату титрування кiлькість мл натрій
гідроксиду, що пiшла на титрування 1-ої проби (0,2мл ), будемо мати слiдуючi
цифри: на титрування другої проби пiшло 0,8мл; 3-ої проби -1,8мл; 4-ої проби -
3,8мл. Кiлькiсть мл натрій гідроксиду, що пiшла на титрування 4-ої проби,
становить 100%. Звiдси ступiнь гiдролiзу дорiвнює: 1) для гiдролiзату,
отриманого через 10 хвилин:
3,8 - 100%
0,8 - Х Х = 21%
522) для гідролізату, отриманого через 40 хвилин:
3,8 - 100% ;
1,8 - Х Х=47,4%
Робота 4.2. Кiлькiсне визначення бiлка в сечi
4.2.1. Метод Стольнiкова
Принцип. Метод заснований на утвореннi бiлого кiльця на межi мiж
концентрованою нітратної кислотою i розчином бiлка (реакцiя Геллера).
Експериментально встановлено, що розчини, що мiстять 0,033 г/л бiлка,
утворюють бiле кiльце в кiнцi другої - на початку третьої хвилин пiсля
нашарування на нітратну кислоту.
Хiд роботи. Розводять дослiджувану сечу 1:10; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50; i т. д.
Для цього готують у пробiрцi початкове розведення сечi 1:10 (в пробiрку
вносять 1 мл дослiджуваної сечi i додають 9 мл дистильованої води). Потiм
готують 8 розведень сечi згiдно зi схемою:
№ пробірки,
розведення
1
1:10
2
1:20
3
1:30
4
1:40
5
1:50
6
1:60
7
1:70
8
1:80
Об`єм сечі, мл
розведеної
1:10
1 1 1 1 1 1 1 1
Об`єм води, мл - 1 2 3 4 5 6 7
З вмiстом кожної пробiрки здiйснюють реакцiю з нітратною кислотою. Для
цього в 8 iнших пробiрок наливають 16 крапель концентрованої нітратної
кислоти, куди обережно по стiнцi, трохи нахиливши пробiрку, нашаровують
пiпеткою 1мл вiдповiдного розведення сечi i вiдмiчають ту пробiрку, в якiй
з'являється бiле кiльце мiж другою i третьою хвилинами. Помножують 0,033 на
розведення сечi в цiй пробiрцi (наприклад, для третьої пробірки - на 30).
Отримують вмiст бiлка в патологічній сечi в г/л (у цьому випадку
0,033•30=0,99 г/л).
4.2.2. Колориметричний метод визначення білка
Принцип. Бiлки з купрум(ІІ)сульфатом в лужному середовищi
утворюють бiуретовий комплекс, забарвлений у фіолетовий колiр.
Iнтенсивнiсть забарвлення комплексу, яка залежить вiд кiлькостi бiлка в
дослiджуваному розчинi, вимiрються на ФЕК.
Хiд роботи. В пробiрку наливають 1 мл профiльтрованої сечi, потiм
4мл 20% розчину натрій хлориду i 1 краплю льодової ацетатної кислоти.
Помiщають пробiрку в кип’ячу водяну баню на 5-10 хвилин для повного
осадження бiлка. Потiм фiльтрують, осад на фiльтрi розчиняють 1мл
фiзрозчину та 4 мл реактиву Вебера (купрум(ІІ)сульфат, калій-натрій тартрат,
натрiй гідрокарбонат, йодид калiю у водi). Розчин знову фiльтрують i через 30
хвилин фотоколориметрують на ФЕК при зеленому свiтлофiльтрі проти
53контролю: 1мл фiзрозчину i 4мл реактиву Вебера. За калібрувальним графіком
знаходять процент білка в сечі.
Клініко-діагностичне значення
Бiлок в нормальнiй сечi знаходиться у виглядi слiдiв, якi не визначаються
звичайними методами, що застосовуються в клiнiчнiй лабораторiї. Поява бiлка
в сечi носить назву протеїнурiї або альбумiнурiї, бо сеча мiстить, в основному,
альбумiн сироватки кровi. Протеїнурiя може бути дiйсною i хибною. При
дiйснiй протеїнурії бiлок сироватки кровi потрапляє в сечу через нирки.
Випадкова або хибна протеїнурiя спостерiгається, якщо в сечу потрапляє слиз,
кров, гнiй з сечовивiдних шляхiв. Бiлок з'являться в сечi при нефритi, серцевий
декомпенсацiї, при деяких формах пiдвищення кров'яного тиску, при
вагiтностi. Сеча, що мiстить бiлок, стає каламутною.
Робота 4.3.1. Кiлькiсне визначення сечовини в сечі за методом
Бородіна
Принцип. Метод Бородіна є газометричним, в основі його лежить
розщеплення сечовини бромноватистим лугом з виділенням вiльного азоту
СО(NН2)2 + 3NаВrО +2NaOH 3NaBr + Na2CO3 + 3H2O+N2
За об'ємом газоподiбного азоту, що видiляється, вираховують вмiст сечовини.
Хiд роботи. Апарат Бородіна промивають i наповнюють насиченим
розчином натрій хлориду. Верхню бюретку наповнюють 6-ма мл сечі,
розведеної в 10 разів i переводять 5 мл сечі в нижню бюретку. Внаслідок
значної рiзницi в питомiй вазi сеча буде знаходитись над розчином натрій
хлориду, не змiшуючись з нию. Залишок сечi з верхньої бюретки виливають
через боковий хiд крана. Промивають верхню частину бюретки дистильованою
водою i наливають у верхню частину бюретки 5-8 мл бромноватистого лугу i
порцiями переводять в нижню частину бюретки до припинення видiлення
азоту. Розраховують, якiй кiлькостi сечовини еквiвалентна кiлькiсть азоту,
зiбраного в апаратi Бородiна, користуючись таблицею Мальчевського, беручи
до уваги температуру та тиск. Розрахунок вмiсту сечовини в добовiй сечi (Х)
може бути проведений за формулою:
а • b • 10 • 1500
Х = , де
5 • 60
а – маса сечовини (в мг), еквівалентна 1 мл азоту за певного тиску та
температури (знаходять за таблицею);
b - об`єм азоту (мл), зібраного в апаратi;
10 – величина, де враховано розведення сечi ;
1500 - кiлькiсть мл добової сечi;
5 – об’єм (в мл) сечi (розведеної), взятої для аналiзу;
60 - коефiцiєнт перерахунку мг в мМ.
54Клініко-діагностичне значення.
В нормi в добовому об’ємі мiститься 330-580 мМ сечовини. Виділення
сечовини підвищується при:
- вживанні їжі з високим вмістом білків;
- при захворюваннях, що супроводжуються розпадом тканин.
Зменшення виділення сечовини характерно для захворювань печінки та при
порушенні фільтраційної здатності нирок.
Робота 4.3.2. Визначення вмісту аміаку в сечі
Вміст амонієвих солей у сечі визначають титрометричним методом після
реакції з формальдегідом.
Принцип. Метод базується на взаємодії солей амонію з формальдегідом, у
результаті чого утворюється гексаметилентетрамін (уротропін) і вивільняється
еквівалентна кількості аміаку кількість хлоридної кислоти, яку відтитровують
розчином натрій гідроксиду:
4NH4CI + 6CH2O N4(CH2)6 + 4HCI + 6H2O
Хід роботи. В колбу наливають 10 мл сечі, додають 1-2 краплі
фенолфталеїну і нейтралізують 0,1М розчином натрій гідроксиду. Додають
рівний об’єм свіжонейтралізованого розчину формальдегіду. Внаслідок
виділення хлоридної кислоти рожеве забарвлення зникає. Суміш титрують
0,1М розчином натрій гідроксиду до появи рожевого забарвлення. За об’ємом
основи, витраченої на титрування, розраховують вміст аміаку в добовій
кількості сечі:
а • 0,0017 • D
Х= , де
10
Х-кількість аміаку в добовій сечі, г;
а- об’єм основи, витраченої на титрування, мл;
0,0017-кількість аміаку, що відповідає 1мл 0,1М розчину натрій гідроксиду
(титр аміаку), г;
D- діурез;
10-об’єм сечі, взятої для аналізу, мл.
Клініко-діагностичне значення
Азот аміака в сечі становить 35,7-71,4 мМ за добу в сечі. Збільшення вмісту
аміаку в сечі свідчить про порушення знешкоджуючої функції печінки, а саме
синтезу сечовини (уреогенезу).
Робота 4.4. Визначення гомогентизинової кислоти в сечі
Принцип: Визначення гомогентизинової кислоти грунтується на її
відновлювальних властивостях (гомогентизинова кислота за будовою є
дигідрохіноном), при окисленні, наприклад, фосфорно-молібденовим
реактивом (утворюється зелене забарвлення).
55Хід роботи. До 1 мл сечі додають 1 мл 0,5М розчину КН2РО4,
перемішують, додають 1 мл 5,0% розчину молібдату амонію на 5N розчину
Н2SO4, перемішують і залишають на 20 хвилин при кімнатній температурі для
розвитку забарвлення. Фотометрують при довжині хвилі 670нм в кюветі 1см (в
контролі замість сечі – 1 мл дистильованої води).
Розрахунок вмісту гомогентизинової кислоти проводять за формулою:
С = 41,8 • D (мкг/мл в пробі), де
D-екстинкцiя ФЕК;
41,8- коефіцієнт перерахунку;
В сечі в середньому може міститись до 28 мкг/мл гомогентизинової
кислоти.
Клініко-діагностичне значення.
Гомогентизинова кислота є продуктом окислювального катаболізму
амінокислоти тирозину. Високий вміст цієї речовини спостерігається при
спадкових захворюваннях (алкаптонурія - відсутність оксидази
гомогентизинової кислоти) та може підвищуватись при деяких інших
патологічних станах (колагенози- ревматизм, тонзиліт та ін.)
Робота.4.5. Визначення триптофану в сечі
(Демонстрація. Методика Мусіна Р.А.)
Принцип. Триптофан є незамінною амінокислотою, надходить в організм
людини з їжею, використовується в синтезі білка, для синтезу медіатора
нервової системи серотоніну, вітаміну В5 . Для визначення триптофану
використовують фотометричну реакцію з тіоацеталями (на першій стадії
відбувається утворення тіоацеталя при взаємодії глюкози та цистеїну в
присутності сірчаної кислоти, а на другому етапі триптофан взаємодіє з
тіоацеталем вуглеводу) і утворюється червоне забарвлення.
Хід роботи: В пробірку послідовно добавляють:
0,25 мл робочого розчину глюкози (містить 200 мкг глюкози)
+1,5 мл концентрованої Н2SO4
+0,1 мл 2% розчину цистеїну (спостерігається утворення тіоацеталя
цистеїну жовтого кольору).
+0,4 мл дистильованої води (забарвлення може зникнути)
+0,2 мл сечі.
Залишають на 30 хвилин. Фотометрують при 540нм в кюветі 0,5см проти
води.
Розрахунок проводять за калібрувальним графіком, який описується
рівнянням:
С = 55,3 • D (мкг триптофану в пробі), де
D- екстинкцiя ФЕК,
55,3- коефіцієнт перерахунку.
Реакція визначення триптофану досить специфічна, але можуть реагувати
також і похідні триптофану (індометацин, триптамін, індол, рауседил та ін.)
5657Робота 4.6.: Визначення сумми відновленого глутатіону і цистеїну
Принцип : SH-група цистеїну та глутатіону має відновлювальні
властивості і може під впливом окислювачів перетворюватись на дисульфідную
форму. За кількістю окислювача, що був використаний у окисно-відновній
реакції, можна розрахувати вміст тіолових сполук в біологічній рідині.
Цистеїн Цистін
Хід роботи. В колбу для тирування вносять 0,5мл ТХ
А (трихлорацетат)-фільтрата крові ( відповідає 1мл цільної крові)
додають 2мл 0,1М розчину HCl, 2 краплі 1% розчину крохмалю і титрують
0,0005М розчином I2 до стійкого синього забарвлення і записують об`єм
розчину йоду що був використаний для титрування. Розрахунки проводять
виходячи з того що 1 моль йоду окислює 2 моля цистеїну (1мл 0,0005М I2
витрачається на 0,001 ммоль цистеїну).
Розрахунок:
А • 0,001 • 1000 мг
Х= = ммоль/л, де:
1 мл
А- кількість мл 0,0005М розчину І2,затраченого на титрування;
0, 001 і 1000 - коефіцієнти перерахунку;
1мл - кількість цільної крові, взятої для дослідження.
В нормі вміст тіолових сполук (глутатіону та цистеїну) в крові 0,9 – 1,50
ммоль/л.
Робота. 4.7. Визначення активностi аланiнамiнотрансферази (2.6.1.2.) в
сироватці кровi динiтрофенiлгiдразиновим методом
Принцип. В результатi переамiнування амінокислоти аланіну, що
проходить пiд дiєю аланiнамiнотрансферази (АлАТ), утворюється
пiровиноградна кислота, яка при додаваннi 2,4-динiтрофенiлгiдразину в
лужному середовищi перетворюється в гiдразон пiровиноградної кислоти.
Іiнтенсивнiсть забарвлення утвореної сполоки пропоцiйна кiлькостi утвореної
пiровиноградної кислоти.
58Хiд роботи. В двi пробiрки (дослiдну i контрольну) вносять по 0,5 мл
субстратної сумiшi (аланiн та ;-кетоглутарова кислота) i помiщають у
термостат при 37°С на 5 хвилин. Потiм у дослiдну пробiрку приливають 0,1 мл
сироватки кровi здорової чи хворої людини, а в контрольну - 0,1 мл води та 0,5
мл розчину 2,4-динiтрофенiлгiдразину i ставлять на iнкубацiю обидвi пробiрки
в термостат при температурi 37°С на протязi 30 хвилин. Виймають пробiрки з
термостату i приливають в дослiдну пробiрку 0,5 мл розчину 2,4-
динiтрофенiлгiдразину i обидвi пробiрки залишають на 20 хвилин при
кiмнатнiй температурi. Потiм додають по 5 мл 0,4N розчину NаОН в кожну
пробiрку, старанно змiшують, залишають при кiмнатнiй температурi на 10
хвилин, пiсля чого фотометрують ФЕК в кюветi товщиною 1 см при зеленому
свiтлофiльтрi супроти контролю.
Розрахунок: активностi ферменту в сироватцi кровi проводять за
калiбрувальною таблицею. Перерахунок активностi ферментiв (Х)мМ
пiровиноградної кислоти, що утворилась при iнкубацiї 1 л сироваткi кровi на
протязi 1 години при 37°С, проводять за формулою:
С • 2 • 10000
Х = , де
88000
10000 – коефіцієнт перерахунку на 1л сироватки;
С - пiровиноградна кислота в мкг, знайдена за калiбрувальною таблицею;
88000 - вага 1мМ пiровиноградної кислоти в мкг;
2 - коефіцієнт перерахунку на 1 год. iнкубацiї, тому що час iнкубацiї
становить 30 хвилин.
У нормi активнiсть аланiнамiнотрансферази становить 0,1-0,68мМ
пiровиноградної кислоти на 1л сироватки кровi за 1 год.iнкубацiї при 37°С (0,1
- 0,68мМ л/год)
Калiбрувальна таблиця.
Екстинкцiя
Активнiсть АлАТ
в мкг ПВК
в 0,1мл сироватки
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
0,31
0,63
0,94
1,25
1,56
1,87
2,20
2,51
2,82
3,13
3,44
3,75
4,06
4,37
4,68
59Клініко-діагностичне значення
Аланінамінотрансфераза є цитозольним ферментом, активність АлАТ
підвищується при інфекційному гепатиті. Аспартатамінотрансфераза (АсАТ) є
мітохондріальним ферментом і її активність підвищується при інфаркті
міокарда.
Робота 4.8. Дослідження кислотності шлункового соку
Принцип. Визначення кислотності шлункового соку полягає в
титруванні вільної хлоридної (соляної) кислоти та кислореагуючих речовин
0,1М розчином натрій гідроксиду. В тій самій пробі шлункового соку
визначається як загальна кислотність в присутності індикатора фенолфталеїна,
так і вміст вільної хлоридної кислоти в присутності індикатора
диметиламіноазобензолу. Вільну хлоридну кислоту і загальну кислотність
шлункового соку прийнято виражати кількістю мл 0,1М розчину натрій
гідроксиду, що пішла на титрування 100 мл шлункового соку в присутності
відповідних індикаторів. Зона переходу двохкольорового індикатору
диметиламіноазобензолу знаходиться в межах рН 2,9-4,0. Фенолфталеїн набуває
забарвлення при рН=8,5. Визначення кислотності шлункового соку проводиться
в трьох пробах шлункового соку (№1, №2, №3).
Хід роботи. В колбочки для титруваня відмірюють по 5 мл шлункового
соку, доливають 1-2 краплі диметиламіноазобензолу і 2 краплі фенолфталеїну.
Титрують 0,1М розчином натрій гідроксиду до появи оранжевого забарвлення і
відмічають кількість лугу, що пішла на титрування вільної хлоридної кислоти
(перша відмітка). Далі продовжують титрування до появи лимонно-жовтого
забарвлення (друга відмітка) і знову відмічають кількість лугу, що пішла на
титрування до другої відмітки. Потім продовжують титрувати до появи
рожевого забарвлення (третя відмітка). Відмічають кількість лугу, що пішла на
титрування від початку до третьої відмітки. На основі отриманих значень
титрування проводять розрахунок загальної кислотності, вільної та зв’язаної
хлоридної кислоти в шлунковому соці. Перша відмітка відповідає кількості
вільної хлоридної кислоти, середнє арифметичне між другою та третьою –
загальній хлоридній кислоті, третя відмітка – загальній кислотності шлункового
соку. Наприклад, на титрування шлункового соку 0,1М розчином натрій
гідроксиду затрачено до першої відмітки (оранжевий колір) – 1 мл, до другої
(лимонний колір) – 2 мл, до третьої (рожевий колір) – 3 мл. Середнє
арифметичне між другою та третьою відміткою – (2+3)/2=2,5. Отже, вільна
НСl :1х20=20, загальна хлоридна кислота – 2,5х20=50, зв’язана хлоридна
кислота 50-20=30, загальна кислотність – 3х20=60.
В нормі зв’язана хлоридна кислота дорівнює 15-20, вільна хлоридна
кислота- 20-40, загальна кислотність шлункового соку- 40-60 титраційних
одиниць.
Клініко-діагностичне значення
60Визначення секреторної функції шлункових залоз проводять за допомогою
аспіраційного зондування. При цьому оцінюють секреторну функцію шлунку
натще, базальну секрецію, та секрецію після введення стимулятора. Найбільш
поширеним стимулятором шлункової секреції є гістамін (вводять у дозі
0,008мг/кг підшкірно), який стимулює до 45% парієтальних клітин.
При захворюваннях шлунку кислотність може бути нульовою,
підвищенною і зниженною. При виразковій хворобі шлунка та гіперацидному
гастриті збільшується вміст хлоридної (соляної) кислоти, загальна кислотність
(гіперхлоргідрія) та виділення пепсину. При гастриті із зменшенною
секреторною активністю і при виникненні пухлин шлунка спостерігається
зменшення вмісту вільної хлоридної кислоти, загальної хлоридної кислоти
(гіпохлоргідрія), що може спричинити припинення виділення соляної кислоти і
зниження загальної кислотності (ахлоргідрія). При злоякісній анемії, розвитку
злоякісних пухлин шлунка може бути повна відсутність хлоридної кислоти та
пепсину (ахілія) в шлунковому соці.
Робота 4.9. Реакція ідентифікації гістаміну солями кобальту
Принцип. Гістамін реагує із солями кобальту з утворенням забарвлених
комплексних солей.
Хід роботи. 0,01-0,02г гістаміну розчиняють в 1 мл дистильованої води,
додають 2-3 краплі розчину кобальта нітрату або кобальта хлориду й краплю
натрій гідроксиду, випадає осад червоно-фіолетового кольору.
Г. Контрольні питання з теми
“Хімія та обмін амінокислот і простих білків”
1.Амінокислоти: класифікація, будова, властивості (замінні і незамінні, умовно
незамінні; гідрофобні та гідрофільні; заряджені, незаряджені).
2.Елементарний склад білків. Функції білків. Методи виділення та очищення
білків. Якісне та кількісне визначення білків. Біуретова реакція.
Амінокислоти та білки як фармпрепарати.
3.Рівні структурної організації білкової молекули ( первинна, вторинна,
третинна, четвертинна, доменна), типи хімічних зв`язків в білкових
молекулах.
4.Фізико-хімічні властивості білків (молекулярна маса, розчинність
амфотерність, гідрофільність, денатурація, осаджування, висолювання, ІЄТ).
5.Класифікація простих білків (за будовою та властивостями), характеристика
окремих класів білків, їх біологічне значення (альбуміни, глобуліни,
протаміни, гістони).
6.Азотистий баланс, його види. Добова потреба людини в білках. Харчове
значення білків. Динамічний стан білків організму. Норма білків в
харчуванні. Білковий мінімум та оптимум. Коефіцієнт зношування.
Повноцінні та неповноцінні білки. Біологічна цінність білків.
7.Перетравлення (ентеральний обмін). Перетравлення простих білків в шлунку,
ферменти, механізм їх активації, ендо- та екзопептидази. Роль HCl. Роль
61муцину. Кінцеві продукти травлення білків в шлунку. Перетравлення білків в
тонкому кишечнику. Всмоктування амінокислот. Фармпрепарати, що
регулюють ентеральний обмін.
8.Гниття білків в товстій кишці (продукти гниття лізину, орнітину,
фенілаланіну, тирозину, триптофану). Механізм знешкодження токсичних
продуктів гниття. Знешкодження індолу. Клінічне значення визначення
тваринного індикану.
9.Пул (фонд) амінокислот: поповнення та використання амінокислот в
організмі. Проміжний обмін простих білків. Трансамінування: ферменти,
коферменти, механізм, значення. Амінотрансферази та механізм їх дії,
клінічне значення визначення трансаміназ.
10.Дезамінування: види, механізм, ферменти, коферменти, значення. Механізм
окислювального дезамінування глутамінової кислоти. Роль глутамінової та
;-кетоглутарової кислот в азотистому обміні. Декарбоксилювання
амінокислот. Утворення та біологічна дія біогенних амінів, їх
знешкодження. Фармпрепарати – інгібітори МАО.
11.Джерела аміаку в організмі. Шляхи знешкодження аміаку (попереднє і
остаточне). Транспортні форми аміаку (утворення АЛА, ГЛУ і ГЛН, АСП і
АСН). Роль глутамінази і аспарагінази. Орнітиновий цикл синтезу сечовини.
Цикл фумарової кислоти та його значення. Сечовина як кінцевий продукт
азотистого обміну, вміст в крові і сечі.
12.Поняття про глюконеогенез, глюкогенні та кетогенні амінокислоти; шляхи
використання пірувату. Особливості обміну та біологічне значення
амінокислот ( Глі, Сер, Цис, Ала, Тре, Глу, Асп, Арг, Гіс, Три, Фен,
Тир). Особливості обміну Мет, значення гомоцистеїну.
13.Поняття про ферментні блоки та молекулярні (спадкові) хвороби
(фенілпіровиноградна олігофренія, кретинізм, альбінізм, алкаптонурія,
хвороба кленового сиропу).
14.Роль печінки в білковому обміні, гепатопротектори. Біохімічні показники
білкового обміну.
15.Яким методом можна визначити в біологічних рідинах: сечовину, білок,
активність трансаміназ та кислотність шлункового соку?
62РОЗДІЛ V
CКЛАДНІ БIЛКИ. НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ. ЕТАПИ ПЕРЕДАЧІ
ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ
А.Питання для підготовки з теоретичного матеріалу.
1.Класифікація та характеристика складних білків.
2.Класифікація та характеристика хромопротеїнів.
3.Гемоглобін: хімічна будова, значення, види та сполуки гемоглобіну.
4.Гемоглобінози.
5.Перетравлювання гемоглобіну.
6.Біосинтез гему, гемоглобіну.
7.Катаболізм гемоглобіну (пігментний обмін).
8.Види жовтяниць. Біохімічна діагностика жовтяниць.
9.Нуклеопротеїни: визначення, значення, будова, характеристика компонентів.
10.Нуклеїнові кислоти: визначення, значення, історія вивчення, мононуклео-
тиди, нуклеозиди. Види структурної організаціі нуклеїнових кислот. Правила
Чаргаффа. Модель ДНК за Кріком та Уотсоном.
11.Перетравлювання нуклеопротеїнів в шлунково-кишковому тракті.
12.Проміжний обмін нуклеопротеїнів. Катаболізм нуклеопротеїнів в тканинах.
13.Біосинтез пуринових мононуклеотидів de novo. Джерела атомів пуринового
ядра.
14.Біосинтез піримідинових мононуклеотидів de novo. Джерела атомів
піримідинового ядра. Біосинтез дезоксирибози та d-ТМФ.
15.Катаболізм пуринових мононуклеотидів в тканинах. Сечова кислота та її
характеристика .
16.Патологія пуринового обміну.
17.Катаболізм піримідинових мононуклеотидів в тканинах.
18.Характеристика геному людини. Молекулярні основи генетичного коду та
його характеристика.
19.Напівконсервативний механізм біосинтезу ДНК (реплікація): визначення,
біологічне значення, фактори , механізм.
20.Пошкодження та репарація ДНК.
21.Транскрипція: визначення , біологічне значення, фактори та механізм.
Значення промоторів та паліндромів. Поняття про процесінг.
22.Трансляція (біосинтез білка): визначення, біологічне значення, фактори,
механізм.
23.Посттрансляційні зміни білків (protein only).
24.Нематричний синтез олігопептидів та білків.
25.Особливості регуляції біоситезу білка у прокаріотів за Жакобо і Моно.
Регуляція білкового синтезу еукаріотів на генетичному рівні, на рівні
транскрипції та трансляції. Особливості регуляції біосинтезу білка у людини.
26.Механізми дії лікувальних препаратів та токсинів на біосинтез білка:
антибіотиків, інтерферону, протипухлинних препаратів, дифтерійного
токсину та аманітину.
6327.Точкові мутації: визначення, види, причини, значення, молекулярні
хвороби.
28.Генна інженерія в фармації.
29.Принципи методів визначення: білірубіну, сечової кислоти в сироватці
крові; уробіліну, сечової кислоти та фенілпіровиноградної кислоти в сечі.
Б.Лiтература
1.Л.М.Вороніна, «Біологічна хімія», Харків, 2000. С. 57-109, 348-426.
2.Ю.І.Губський, «Біологічна хімія», Київ-Тернопіль, 2000. С. 41-57, 270-326,
419-423, 462-468.
3.Е.А.Строев «Биологическая химия», Москва, 1986. С. 69-84,292-339.
4.Я.І.Гонський та співавтори ”Біохімія людини”, Тернопіль, 2002, С. 52-62,
435-506, 553-566.
В.Опис лабораторних робiт
Робота 5.1 Видiлення казеїну з молока
Принцип. Фосфопротеїн казеїноген в молоцi знаходиться у вигляді
розчиненої кальцiєвої солi, тобто у виглядi анiонiв. Вiльний казеїноген у формі
електронейтральних молекул характеризується малою стабiльнiстю у розчинi.
Тому при підкисленні молока (рН=4,7) казеїноген випадає в осад у виглядi
казеїну (молоко "згорається").
Хiд роботи. До 2 мл молока додають 2 мл дистильованої води i 2 краплi
10% розчину ацетатної кислоти. Утворюється осад казеїну, який
вiдфiльтровують, а осад знiмають з фiльтру скляною паличкою та помiщають в
чистi пробiрки.
Для доказу бiлкової природи казеїну з осадом здiйснюють кольоровi реакцiї
на бiлки: бiуретову, нiнгiдринову та Фоля (див роб. 1.9; 1.10; 1.12)
Робота 5.2 Видiлення глiкопротеїну (муцину) з слини та нафтолова
проба на вуглеводний компонент
При пiдкисленнi слини муцин випадає в осад. Для доказу наявностi в
муцинi глюкози виконують нафтолову пробу.
Принцип. При дiї концентрованої сульфатної кислоти з глюкози
утворюється оксиметилфурфурол, який конденсується з ;-нафтолом i утворює
сполуку фiолетового кольору.
Хiд роботи. В пробiрку збирають 2 мл слини i по краплям приливають
концентровану ацетатну кислоту (4-5 крапель) до утворення осаду муцину.
Рідину обережно зливають, затримують згусток муцину скляною паличкою. Зi
згустком муцину виконують нафтолову пробу на його вуглеводний компонент.
Для цього до згустку добавляють 1-2 краплi 1% спиртового розчину ;-нафтолу,
змiшують i обережно по стiнцi нашаровують концентровану сульфатну кислоту
(в об’ємi, рiвному вмiсту пробiрки). На межi роздiлу двох шарiв рiдини
поступово з’являється фiолетово-червоне кiльце, добре помiтне на бiлому фонi.
Робота 5.3 Специфiчнi реакцiї на гем гемоглобiну
64Принцип: При додаваннi до розведеного розчину кровi розчину
бензидину та гідроген пероксиду, проходить окислення бензидину з
утворенням забарвлених продуктiв реакцiї (бензидинова проба на кров).
Бензидин окислюється в дифенохiнондимiн, що має синє забарвлення, яке
через деякий час переходить у червоне. Гемоглобiн виконує роль каталiзатора
реакцiї.
Хiд роботи. До 5 крапель розведеної кровi додають 2 краплi 0,2%
спиртового розчину бензидину та 2 краплi 3% гідроген пероксиду. Рiдина
набуває синього забарвлення, яке через деякий час переходить у червоне.
Клініко-діагностичне значення
Проба застосовується в судово-медичній практицi для доказу наявностi
кров’яних плям, в клiнiцi - для знаходження малих кiлькостей кровi в
бiологiчних об’єктах: шлунковому соцi, калi i т.д.
Робота 5.4 Якiсне визначення уробiлiну в сечi
Проба Флоранса на уробiлiн
Принцип. Уробiлiн з концентрованою хлоридною кислотою утворює
рожеве забарвлення.
Хiд роботи. До 5 мл сечi додають 6 крапель концентрованої сульфатної
кислоти, 3 мл ефiру, закривають корком, обережно збовтують. Дають рiдинi
вiдстоятися. В наступну пробiрку наливають 2-3 мл концентрованої хлоридної
кислоти, на неї нашаровують ефiрну витяжку. В присутностi уробiлiну на межi
роздiлу двох рiдин через кiлька хвилин утворюється рожеве або червоне кiльце.
Iнтенсивнiсть забарвлення залежить вiд вмiсту уробiлiну.
Клініко-діагностичне значення
Визначення уробіліну в сечі застосовується для біохімічної діагностики
жовтяниць. У здорових людей уробіліноген (уробілін) міститься в сечі в малих
кількостях. Уробілінурія спостерігається: при паренхіматозній жовтяниці,
гемолітичних анеміях, при отруєнні свинцем. Уробілін не міститься в сечі при
механічній жовтяниці.
Робота 5.5 Кiлькiсне визначення загального бiлiрубiну в сироватцi
кровi (за методом Йєндрашика)
Принцип. Зв’язаний бiлiрубiн утворює з дiазореактивом (дiазотована
сульфанiлова кислота) рожево-фiолетовий розчин азобарвника. За
iнтенсивністю забарвлення, яку дослiджують фотоколориметрично,
визначають концентрацiю прямого бiлiрубiну. В присутностi кофеїнового
реактиву (непрямий) бiлiрубiн переходить в розчинений дисоцiйований стан,
завдяки чому вiн дає рожево-фiолетове забарвлення з сумiшшю дiазореактиву.
За iнтенсивністю цього забарвлення фотоколориметрично визначають
концентрацiю загального бiлiрубiну. Рiзниця мiж загальним та з’язаним
бiлiрубiном дорiвнює вмiсту вiльного бiлiрубiну, який не дає пряму реакцiю.
Хід роботи. В чотири пробірки (дві дослідні та дві контрольні) для
визначення загального білірубіну вносять рективи за таблицею:
65Реактиви Загальній
білірубін
Контроль Загальний
білірубін
Контроль
Сироватка здорової людини,
Сироватка хворої людини
хх
Кофеїновий реактив
Фізіологічний розчин
Діазосуміш
0,50
1,75
-
0,25
0,50
1,75
0,25
-
0,50
1,75
-
0,25
0,50
1,75
0,25
-
Висновки
Сироватка крові здорової людини – донорська.
хх
Сироватка крові хворої людини – штучна.
Для визначення загального білірубіну пробу залишають на 20 хвилин для
розвитку стійкого забарвлення. Фотоколориметрують при зеленому
світлофільтрі (довжина хвилі 500–560 нм) в кюветі товщиною 5мм.
Розрахунок проводять за калібрувальною таблицею. Від показника
екстинкції загального білірубіну віднімають показник екстинкції контролю. В
нормі кількість загального білірубіну становить від 8,5 до 20,5 мкМ/л (75% від
цієї кількості припадає на непрямий білірубін, а 25% - на прямий).
Приклад розрахунку: Значення екстинкції дослідної пробірки
(загальний білірубін) 0,20, що відповідає за калібрувальною таблицею 35,1
мкМ/л; а значення екстинкції контролю – 0,12, що відповідає за
калібрувальною таблицею 15,4 мкМ/л. Різниця складає: 35,1–15,4=19,7 мкМ/л –
кількість загального білірубіну що відповідає нормі.
Таблиця перерахунку бiлiрубiну (свiтлофiльтр №6; кювета №10)
Показник
екстинкції
Концен-
трація
білірубіну
мкмоль/л
Показник
Екстинкції
Концентрація
білірубіну
Мколь/л
Показник
екстинкції
Концентрація
білірубіну
мкмоль/л
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
0,19
0,20
0,21
0,22
0
1,71
3,40
6,00
8,60
11,10
12,80
15,40
17,1
21,4
23,1
25,7
28,2
29,9
33,4
35,1
37,6
40,2
0,25
0,23
0,29
0,30
0,31
0,32
0,33
0,34
0,35
0,36
0,37
0,38
0,39
0,40
0,41
0,42
0,43
0,44
51,3
53,9
56,4
59,9
61,6
64,1
65,8
68,4
71,0
73,0
75,2
78,7
80,4
83,0
85,5
87,2
88,8
91,5
0,49
0,50
0,51
0,52
0,53
0,54
0,55
0,56
0,57
0,58
0,59
0,60
0,61
0,62
0,63
0,64
0,65
0,66
101,8
106,0
108,6
111,2
112,9
115,5
117,2
118,9
122,3
124,9
125,6
129,1
130,8
133,4
135,1
139,4
142,0
143,7
660,23
0,24
0,25
0,26
41,9
44,5
47,0
48,7
0,45
0,46
0,47
0,48
93,2
95,6
97,5
100,1
0,67
0,68
0,69
146,2
148,0
150,5
Клініко-діагностичне значення.
Проба застосовується в медичній практиці для біохімічної діагностики
жовтяниць. Підвищення вмісту загального білірубіну спостерігається при
обтураційній, паренхіматозній та гемолітичній жовтяницях. При паренхіма-
тозній та обтураційній жовтяницях підвищення вмісту загального білірубіну
відбувається в основному за рахунок прямого білірубіну, при гемолітичній
жовтяниці – в основному за рахунок непрямого білірубіну.
Робота.5.6. Якiсний аналiз нуклеопротеїнiв, отриманих з дрiжджiв
Принцип. Якiсний аналiз нуклеопротеїнiв, заснований на визначеннi
речовин, що входять до їх складу i звiльняються при гiдролiзi. Схема повного
гiдролiзу нуклеопротеїнiв може бути подана таким чином:
Бiуретовою реакцiєю вiдкривають полiпептиди, пуриновi основи - за
утворенням осаду солей аргентуму, фосфатну кислоту - за реакцiєю з амоній
молiбдатом, пентозу – за реакцiєю Фелiнга.
Хiд роботи: I етап: кислотний гiдролiз нуклеопротеїнiв дрiжджiв
(виконується завчасно лаборантом).
1 г дрiжджiв помiщають у плоскодонну колбу на 100 мл, додають 20 мл
10% розчину сульфатної кислоти та 20 мл дистильованої води. Колбу
закривають корком з довгою трубкою та кип’ятять пiд тягою на азбестовій
сiтцi при слабкому нагрiваннi. Через годину пiсля початку кип’ятiння колбу
охолоджують, вмiст переносять в мiрний цилiндр, доводять до 100мл, потiм
фiльтрують. З фiльтратом проводять якiсний аналiз.
II етап: якiснi реакцiї на складовi частини гідролізату нуклеопротеїнiв
дріжджів (виконується студентвми).
а) Бiуретова реакцiя на полiпептиди (див.роботу 1.9)
67б) Срiбна проба на пуриновi основи. До 5 крапель гiдролiзату додають 5
крапель 2% амiачного розчину аргентум нітрату. Через 3-5 хвилин випадає
крихкий осад бурого забарвлення, обумовленого утворенням срiбних сполук
пуринових основ.
в) Проба Фелiнга на рибозу чи дезоксирибозу. До 5 крапель гiдролiзату
додають 5 крапель 7% розчину купрум(ІІ)сульфату та 5 крапель лужного
розчину калій, натрій тартрату. Рiдину перемiшують (на кип’ячiй водянiй банi).
Випадає червоний осад купрум(І)оксиду.
г) Молiбденова проба на фосфатну кислоту.
До 5 крапель гiдролiзату доливають 10 крапель молiбденового реактиву, що
являє собою розчин амонiй молібдату в нітратній кислотi, кип’ятять кiлька
хвилин. При охолодженнi випадає жовтий кристалiчний осад комплексної
сполуки амонiй фосфомолібдату.
Робота 5.7. Якiсна реакцiя на сечову кислоту
Принцип. Сечова кислота володіє відновлюючими властивостями і при
нагріванні відновлює окиси металів до їх закисів, наприклад Сu(OH)2 в Сu2О,
осад цегельно-червоного кольору.
Хiд роботи. Пучку сечової кислоти розчиняють в 2 мл розчину 10%
NаОН та додають 16 крапель розчину 1% СuSО4, до утворення слабкої каламутi
Сu(ОН)2, що не зникає при збовтуваннi, а потiм кип’ятять, утворюється
цегельно-червоний осад Сu2О.
Клініко-діагностичне значення
Сечова кислота є кiнцевим продуктом обмiну пуринових нуклеотидiв. З
сечею за добу видiляється бiля 0,5г сечової кислоти, що складає 1-3% вiд азоту
сечi. Кiлькiсть видiленої з сечею сечової кислоти залежить вiд кiлькостi
пуринiв їжi. При харчуваннi їжею, багатою на пурини, видiлення сечової
кислоти з сечею пiдвищується. Сечова кислота входить до складу сечових
камінців у виглядi кислого натрiй урату, є головною складовою частиною
подагричних вiдкладень в сполучній тканині. Сечова кислота може iснувати у
виглядi таутомерних форм.
Робота 5.8. Кiлькiсне визначення сечової кислоти в сечi
Принцип. Сечова кислота вiдновлює фосфатвольфраматний реактив, у
результатi утворюється вольфрам оксид синього кольору; iнтенсивнiсть
забарвлення прямопропорцiйна кiлькостi речовини.
Хiд роботи. В контрольну пробiрку (мiрну) наливають 1,5 мл
дистильованої води, в дослiдну (мiрну) - 1,5 мл розведеної в 50 разiв сечi. В
обидвi пробiрки доливають по 0,7 мл насиченого розчину натрiй карбонату i по
0,05 мл реактиву Фолiна, що складається з натрій вольфрамату, орто-фосфатної
кислоти та дистильованої води. Розчин синiє. Об`єм рiдини в обох пробiрках
доводять водою до 10 мл. Колориметрують на ФЕК з червоним свiтлофiльтром
супроти контролю в кюветах товщиною 10 мм. Розрахунок вмiсту сечової
кислоти (Х) проводять за формулою:
68 а • b • В
Х = , мМ/добу де:
1,5 • 1000
а - кiлькiсть сечової кислоти в пробi в мкМ, що знайдена за калiбрувальною
таблицею;
b - розведення сечi (в даному випадку в 50 разiв);
В – кількість сечi в мл, виділеної за добу;
1,5 – кількість розведеної сечі, що взята для дослідження;
1000 - коефiцiєнт перерахунку мкМ в мМ.
В нормi людина видiляє вiд 1,2 до 7,1 мМ сечової кислоти за добу.
Калiбрувальна таблиця дл я визначення сечової кислоти.
Екстинкцiя Кiлькiсть сечової
кислоти в мкМ
Екстинкцiя Кiлькiсть сечової
кислоти в мкМ
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,012
0,024
0,048
0,071
0,095
0,07
0,08
0,09
0,10
0,12
0,143
0,167
0,190
0,211
0,238
Клініко-діагностичне значення
Сечова кислота є кінцевим продуктом обміну пуринових азотистих основ.
Гіперурикурія – збільшення концентрації сечової кислоти в сечі
спостерігається при усіх захворюваннях, які супроводжуються розпадом
нуклеопротеїнів: подагра, лейкози, променева хвороба, опіки, крупозне
запалення легенів, ревматизм, гемолітична анемія, серпоподібно-клітинна
анемія, вірусний гепатит В, синдром Леша-Ніхана, отруєння свинцем,
токсикози.
Гіпоурикурія – зменшення концентрації сечової кислоти в сечі спостері-
гається при нефриті, нирковій недостатності, прогресивній м’язовій атрофії,
ксантинурії, інтоксикації свинцем.
Робота 5.9 Якiсна реакцiя на фенiлпiровиноградну кислоту (проба
Фелінга)
Принцип.. Фенiлпiровиноградна кислота утворює з iонами
тривалентного феруму комплексну сполуку, забарвлену в синьо-фіолетовий
колiр.
Хiд роботи. Для дослідження беруть 2 пробірки. В одну пробірку
вносять 2 мл свiжофiльтрованої сечi здорової дитини, в другу – 2 мл
патологічної сечі (штучної) хворої дитини на фенілпіровиноградну
олігофренію. В кожну пробірку додають по 2 краплi 10% розчину FeCI3.
В пробірці з патологічною сечею з’являється синьо-фiолетове
забарвлення, що підтверджує наявність в ній фенілпіровиноградної кислоти..
Клініко-діагностичне значення
69Спадкова вiдсутнiсть у дiтей в печiнцi ферменту фенiлаланiнгiдроксилази
приводить до того, що фенiлаланiн не гiдроксилюється i не перетворюється у
тирозин. Накопичення фенiлаланiну та продуктiв його аномального
розщеплення, зокрема фенiлпiровиноградної кислоти, в кровi та тканинах
приводить до порушення нормального розвитку мозку та появи тяжких
порушень психіки дитини. Доказом даного спадкового захворювання -
фенiлпiровиноградної олiгофренiї (недоумства) є виявлення пiдвищеного
вмiсту фенiлаланiну в кровi та наявності фенiлпiровиноградної кислоти в сечi.
Робота 5.10. Визначення сечової кислоти в сироватці крові
Принцип. Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив
Фоліна з утворенням сполуки блакитного кольору, екстинкція якої за довжини
хвилі 670 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти у сироватці крові.
Хід роботи. У центрифугальну пробірку вміщують 0,5 мл сироватки
крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і добавляють
0,35М розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл 10% розчину натрій
вольфрамату. Вміст пробірки перемішують і через 5хв. центрифугують
протягом 10хв. із швидкістю 3000 об/хв.
Проводять визначення вмісту сечової кислоти за таблицею:
Реактиви Контрольна
проба, мл
Стандартна
проба, мл
Дослідна
проба, мл
Надосадова рідина - - 2
Стандартний розчин сечової
кислоти
- 2 -
Вода дистильована 2 - -
Розчин натрій карбонату 1 1 1
Фосфатвольфраматний
реактив Фоліна
0,5 0,5 0,5
Вміст пробірок перемішують. Через 30 хв. визначають екстинкцію
стандартної та дослідних проб на ФЕК за довжини хвилі 670 нм (590-700 нм
червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі завтовшки 10 мм.
Забарвлення є стабільним протягом 30 хв.
Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:
С = D0 / Dc • 30 • 10, де:
С - вміст сечової кислоти у дослідній пробі, мкмоль/л;
D0 - екстинкція дослідної проби;
Dc - екстинкція контрольної проби;
30 - вміст сечової кислоти у стандартному розчині, мкмоль/л;
10 - величина розведення сироватки.
У чоловіків вміст сечової кислоти у сироватці крові за цим методом
становить 240-500 мкмоль/л, у жінок – 160-400 мкмоль/л.
Наведеним методом можна визначати кількість сечової кислоти у сечі, однак її
попередньо необхідно розвести у 10 разів дистильованою водою.
70Клініко-діагностичне значення
Рівень сечової кислоти в крові підвищується внаслідок порушення її
продукції, руйнування, виведення і перерозподілу в організмі у разі посиленого
розпаду клітин, порушення виведення цього метаболіту з сечею, змін
ендокринної регуляції обміну пуринових основ, а також при подагрі.
Гіперурикемію (збільшення концентрації сечової кислоти в крові) можна також
спостерігати при довготривалій терапії салуретиками, сечогінними препа-
ратами, при лікуванні лейкозів цитотоксичними препаратами. Гіпоурикемію
(зменшення концентрації сечової кислоти в крові) спостерігають при:
гепатоцеребральній дистрофії (хвороба Коновалова-Вільсона), деяких
злоякісних новоутвореннях (лімфогранульомі, бронхогенних новоутвореннях),
а також при вживанні саліцилатів, кортикотропіну, піперазину, атофану.
Робота 5.11 Визначення вмісту ДНК в гідролізаті щитовидної залози
за методом Діше
Принцип. Метод грунтується на реакції між дифеніламіном і
дезоксирибозою (реактив Діше), яка відокремлюється від нуклеотидів в
результаті повного кислотного гідролізу.
Хід роботи. Беруть дві пробірки (контрольну та дослідну). В
контрольну вносять 2 мл дистильованої води, а в дослідну – 2 мл гідролізату
щитовидної залози, який отриманий зазделегідь лаборантами з 0,25 г наважки
щитовидної залози. В кожну пробірку додають по 2 мл реактива Діше.
Пробірки залишають на 10 хвилин при кімнатній температурі. В дослідній
пробірці з’являється синє забарвлення, інтенсивність якого вимірюють на ФЕК
при ;= 670 нм, в кюветі 1см проти контролю. Значення екстинкції, отримане на
ФЕК, переводять в концентрацію за калібрувальним графіком. Отриманий
результат підставляють в формулу, за якою розраховують вміст ДНК в
гідролізаті.
Формула розрахунку:
а • 4
Х = мг/г, де
0,25 • 2 • 1000
в чисельнику:
а - кількість ДНК в мкг, знайдена за калібрувальним графіком;
4 - об’єм розчину в мл;
в знаменнику:
0,25 – наважка щитовидної залози, г;
2 – об’єм гідролізату, взятого для дослідження, мл.
1000 - перерахунок мг в г.
Робота 5.12 Визначення вмісту РНК в біологічному матеріалі
(гідролізаті дріжджів) за методом Мейбаума
71Принцип. Кількісне визначення РНК основане на взаємодії рибози з
орцином. Рибоза утворюється в результаті повного гідролізу РНК, отриманої з
дріжджів. При взаємодії останньої з хлоридною кислотою утворюються похідні
фурфурола, які при нагріванні з орцином дають продукт, забарвлений в синьо-
зелений колір.
Хід роботи. Беруть 2 пробірки (контрольну і дослідну). В контрольну
вносять 2 мл дистильованої води, в дослідну – 2 мл гідролізату дріжджів,
отриманого заздалегідь лаборантами з 0,25 г наважки дріжджів. Обидві
пробірки нагрівають 5 хвилин на водяній бані при температурі 60
о
С. Потім в
кожну пробірку додають по 2 мл розчину орцину. З’являється синьо-зелене
забарвлення, інтенсивність якого вимірюють на ФЕК при ;= 670 нм в кюветі
1см проти контролю.
Значення екстинкції, отримане на ФЕК, переводять в концентрацію за
калібрувальним графіком. Отриманий результат підставляють в формулу, за
якою розраховують вміст РНК в гідролізаті дріжджів.
Формула розрахунку:
а • 4
Х= мг/г, де
0,25 • 1000 • 2
а - кількість РНК в мкг, знайдена за калібрувальним графіком;
4 - об’єм розчину в мл;
1000 - перерахунок мг в г;
0,25 - наважка дріжджів в г;
2 – об’єм гідролізату, взятого для дослідження, мл.
Робота 5.13. Визначення ДНК за фосфором
Принцип методу. Метод грунтується на отриманні вільних нуклеїнових
кислот із наступним визначенням кількості ДНК за фосфором, що утворюється
у формі фосфату після мінералізації ДНК. Виявлення фосфору проводять
фотоколориметрично реакцією з амоній молібдатом за присутності відновника
(аскорбінова кислота). Інтенсивність забарвлення продукту реакції
(молібденової сині) є пропорційною кількості фосфору в пробі.
Хід роботи. I етап – приготування мінералізату (готується завчасно
лаборантом).
1.1.Оброблення тканин основою. Наважку тканини печінки масою 100 мг
нагрівають з одним мл 1М розчину натрій гідроксиду в центрифугальній
пробірці протягом 15 хв. на кип’ячій водяній бані.
1.2.Послідовне осадження білків і ДНК. Пробу поступово охолоджують
до 0
о
С (лід). До охолодженого гідролізату додають 0,5 мл насиченого розчину
NaCl в 20 % розчині ацетатної кислоти. Утворений осад білка видаляють
центрифугуванням протягом 5 хвилин при швидкості 5000 об/хв. До
центрифугату додають 6 мл етилового спирту і витримують протягом однієї
години на холоді до повного осадження ДНК. Ще раз центрифугують протягом
725 хвилин при швидкості 5000 об/хв. Утворений осад ДНК відмивають 5 мл 5 %
розчину трихлорацетатної кислоти.
1.3. Приготування мінералізату ДНК.
Осад ДНК кількісно переносять в колбу К’єльдаля, додають 1,5мл
концентрованої сульфатної кислоти і мінералізують на піщаній бані до повного
освітлення розчину. Для прискорення мінералізації до розчину обережно
додають декілька крапель 30 % розчину гідроген пероксиду (по 1 краплі). Після
закінчення мінералізації рідину з колби К’єльдаля кількісно (вимірюючи об’єм)
переносять у колбу Ерленмеєра. Розчин нейтралізують 30 % розчином натрій
гідроксиду за допомогою універсального індикатору. Отриманий мінералізат
переносять кількісно у мірну колбу на 50 мл і доводять до позначки
дистильованою водою.
II етап – визначення ДНК за фосфором. Виконують студенти.
В пробірку відбирають 5 мл мінералізату ДНК, додають 0,5 мл 2,5 %
розчину амоній молібдату, 0,5 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і 4 мл
дистильованої води. Через 10 хвилин вимірюють оптичну густину розчину
проти води при червоному світлофільтрі (довжина хвилі 670 нм) у кюветах
завтовшки 5 мл. Вміст фосфору визначають у мкг за калібрувальною кривою.
Для побудови калібрувального графіка використовують стандартні розчини
калій дигідрогенфосфату, які містять відповідно 1, 2, 3, 4 мкг фосфору в 1 мл
проби. На осі абсцис відкладають значення концентрації стандартних розчинів,
а на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Вміст ДНК
виражають у мг на 100 г тканини. Нормальний вміст ДНК у тканині печінки
щурів становить 25-35 мг %.
Г.Контрольні питання з теми:
«Хімія і обмін складних білків»
1.Складні білки: визначення , класифікація, стисла характеристика окремих
класів.
2.Хромопротеїни: визначення, класифікація, біологічне значення. Хімічна
будова і значення гемоглобіну.
3.Види і сполуки гемоглобіну.
4.Патологія Нв. Гемоглобінози.
5.Перетравлювання гемоглобіну в шлунково-кишковому тракті.
6.Біосинтез гемоглобіну.
7.Катаболізм Нв в тканинах (пігментний обмін). Біохімічна діагностика
жовтяниць.
8.Коротка характеристика нуклеопротеїнів.
9.Історія вивчення нуклеїнових кислот. Сучасні дослідження молекулярної
біології та генетики.
10.Нуклеїнові кислоти: визначення, види, біологічне значення.
11.Склад і структура нуклеотидів і нуклеозидів (азотисті основи, вуглеводний
компонент). Будова полінуклеотидного ланцюга.
12.ДНК: структурна організація. Правила Чаргаффа.
7313.Модель Уотсона та Кріка. Денатурація і ренатурація ДНК.
14.РНК: склад, класифікація, характеристика окремих класів.
15.Перетравлювання нуклеопротеїнів в шлунково-кишковому тракті,
всмоктування продуктів гідролізу.
16.Проміжний обмін нуклеопротеїнів. Джерела атомів пуринового і
піримідинового ядер. Синтез пуринових і піримідинових мононуклеотидів
(МНТ).
17.Синтез дезоксирибози і d-ТМФ. Інгібітори синтезу ТМФ – протипухлинні
препарати.
18.Розпад піримідинових мононуклеотидів в тканинах. Кінцеві продукти
катаболізму. Вміст сечової кислоти в крові, сечі. Порушення пуринового
обміну.
19.Молекулярні основи генетичного коду, його характеристика.
20.Біосинтез ДНК (реплікація): визначення, біологічне значення, фактори,
механізм.
21.Пошкодження і репарація ДНК.
22.Транскрипція: визначення, біологічне значення, фактори, механізм.
Значення промоторів і паліндромів. Поняття про процесінг.
23.Трансляція (біосинтез білка): визначення, біологічне значення, фактори,
механізм. Посттрансляційні зміни білків.
24.Механізм регуляції білкового синтезу у прокаріотів і еукаріотів (на
генетичному рівні, на рівні транскрипції і трансляції).
25.Особливості регуляції біосинтезу білка у людини. Механізм дії інгібіторів
матричного синтезу білка: антибіотиків, протипухлинних препаратів.
26.Механізм дії препаратів і токсинів: інтерферону, дифтерійного токсину,
аманітину та інших.
27.Нематричний синтез олігопептидів і білків. Пептидоглікани.
28.Механізм та значення точкових мутацій.
29.За допомогою яких методів можна визначити: білірубін, сечову кислоту в
сироватці крові; уробілін, сечову кислоту та фенілпіровиноградну кислоту в
сечі ?
74РОЗДІЛ VI
ХІМІЯ ТА ОБМІН ВУГЛЕВОДІВ
А. Питання для підготовки з теоретичного матеріалу
7525.Патологія вуглеводного обміну, цукровий діабет, його біохімічна
Робота 6.1.
76слини
•
Отже, 1 мл слини за ЗО хвилин при 38°С може розщепити 160 мл 1%
розчину крохмалю до стадії еритродекстринів. Це буде амілолітична сила
слини, що досліджується. Позначимо її літерою А, можемо написати, що А =
160 (38°С, ЗО хвилин). В нормі амілазна активність слини дорівнює 160-312.
Робота 6.2.
––
77в) Реакція Біаля на пентози
Робота 6.3
78Солі бісмуту особливо зручні для визначення цукру в сечі, тому що на відміну
Робота 6.4
Робота 6.5. Експрес-аналіз (скрииінгова оцінка) вмісту глюкози в
крові та сечі за допормогою глюкотесту
Принцип. Для візуального напівкількісного визначення – скринінгової
оцінки вмісту глюкози в крові та сечі використовують спеціальні тест-полоски
фільтрувального паперу, які містять реактиви, чутливі до глюкози. Паралельно
з глюкозою такі тест-полоски дозволяють визначити наявність інших
метаболітів, що мають значення для діагностики захворювань. Визначення
основане на зміні забарвлення цих реактивів.
Найбільш відомими вважаються:
1) тест-полоски ”Глюкоуротест” для виявлення і напівкількісного
визначення вмісту глюкози в сечі (НТХ “Аналіз-Х”);
2) діагностичні полоски ФАН “Lachema”, в тому числі “ГлюкоФАН” – для
визначення глюкози в сечі; “ДіаФАН” – для визначення концентрації глюкози
і кетонових тіл в сечі; “ПентаФАН”; “ГексаФАН”;
3) тест-полоски фірми “Cormay”: Cormay Uritest – 1; Cormay Uritest – 2;
794) інші індикаторні тест-полоски.
Хід роботи. Для визначення вмісту глюкози каплю досліджуваної
рідини: патологічної сечі або крові наносять на індикаторну зону тест-полоски.
Забарвлення, яке при цьому з’являється, порівнюють із стандартною
кольоровою шкалою, нанесеною на поверхню футляра, де зберігаються тест-
полоски.
Для об’єктивізації оцінки результатів використовують “глюкометри”, що
дають цифрову інформацію про рівень глюкози в досліджуваній сечі або крові.
Клініко-діагностичне значення
Метод має важливе клінічне значення для щвидкого приблизного
визначення вмісту глюкози в біологічних рідинах. Використовуючи даний
метод, хворі на цукровий діабет можуть самостійно контролювати вміст
глюкози в сечі та крові.
Робота 6.6.
Робота 6.7
80У нормі вміст глюкози в крові орто-толуїдиновим методом складає 3,3-
81Калібрувальна таблиця для визначення глюкози (в мМ).
Робота 6.8
82 Робота 6.
В три пробірки до фільтрату додають точно по 2 мл 0,005М розчину
червоної кров'яної солі (гексаціано(ІІІ) ферат калію) і кип’ятять 15 хвилин,
охолоджують. Додають по 2 мл "трійчастого" розчину солей (цинк сульфат,
натрій хлорид, калій йодид), по 3 мл 3% розчину ацетатної кислоти і по 2-3
краплі 1% розчину крохмалю. З'являється синє забарвлення. Титрують 0,005М
розчином тіосульфату до зникнення синього забарвлення.
83Патологічні гіперглікемії найчастіше пов’язують із захворюваннями
84Робота 6.11
Робота 6.12
Робота 6.13
Принцип. Метод грунтується на кольоровій реакції, яка відбувається в разі
нагрівання сіалових (нейрамінової) кислот з реактивом Гесса. Інтенсивність
бурувато-рожевого забарвлення залежить від концентрації сіалових кислот.
Хід роботи. В пробірку для центрифугування наливають 1 мл штучної
сироватки крові, додають 1 мл 10% розчину трихлорацетатної кислоти. Суміш
перемішують, пробірку закривають фольгою та ставлять у кип’ячу водяну баню
на 5хв. Охолоджують її в воді з льодом. Це призводить до вивільнення зв’язків
нейрамінової кислоти з білковою частиною молекули нуклеопротеїнів. Суміш
центрифугують або обережно фільтрують. До 0,4 мл надосадової рідини
додають 5 мл реактиву Гесса і знову кип’ятять у водяній бані протягом 30хв,
закриваючи пробірку фольгою. Після охолодження фотометрують на ФЕК у
кюветах на 10 мм проти води при зеленому світлофільтрі (546нм). Отриману
величину екстинкції домножують на 1000. Результати вимірювання виражають
в умовних одиницях. У нормі величина коливається від 100 до 720 мг/л (0,7 г/л)
ацетилнейрамінової кислоти.
85У нормі здорової людини з сечею за добу виділяється до 0,02% глюкози,
яку не визначають звичайними методами.
Робота 6.14
Робота 6.15 Кількісне визначення концентрації молочної кислоти в
сироватці крові за методом Бюхнера
•
––
––
86У крові здорової людини міститься 1-2 мМ
Робота 6.16 Кількісне визначення концентрації піровиноградної
кислоти в сечі колориметричним методом
Принцип. Піровиноградна кислота з 2,4-динітрофенілгідразином (2,4-
ДНФГ) у лужному середовищі утворює 2,4-динітрофенілгідразони
піровиноградної кислоти коричнево-червоного забарвлення, інтенсивність
якого пропорційна концентрації піровиноградної кислоти і визначається
колориметрично.
• •
•
Робота 6.
Принцип. Окиснення глюкози киснем повітря під дією глюкозооксидази з
утворенням гідроген пероксиду, який в присутності фенолу з 4–амінофе-
назоном (4-аміноантипірином) утворює забарвлену сполуку.
87Хід роботи
Робота 6.18.
881.Визначення вуглеводів, їх класифікація, біологічна роль. Вуглеводи та їх
8930.Фізико-хімічні властивості глюкози та інших вуглеводів, на яких базуються
90РОЗДІЛ VII
ХІМІЯ ТА ОБМІН ЛІПІДІВ
А. Питання для підготовки з теоретичного матеріалу
914.Я.І.Гонський та співавтори, “Біохімія людини”, Тернопіль 2002. С. 213-243Ю
В. Опис лабораторних робіт
Робота 7.1
Робота 7.2
Робота 7.3.
Робота 7.4
92(А - В)
Робота 7.5
Робота 7.6
93суміші в колбочки відповідними піпетками (контрольною та дослідною),
Робота 7.7
Робота 7.7.1.
Робота 7.7.2.
(З частини 0,1% розчину ферум
хлориду (ІІІ) у льодовій ацетатній кислоті і 2 частини концентрованої
сульфатної кислоти)
Визначення вільного холестерину: В пробірку вносять
2мл кольорового реактиву та мікропіпеткою відміряють 0,04 мл сироватки
крові, змішують і залишають на одну годину при кімнатній температурі. Потім
колориметрують на ФЕК проти контрольної пробірки (кольоровий реактив) у
кюветі товщиною шару 5 мм при зеленому світлофільтрі.
Визначення загального холестерину: Рідину з кювети, в якій визначали
вільний холестерин,переливають у пробірку,кип’ятять 3 хвилини,
охолоджують до кімнатної температури і її вміст колориметрують на ФЕК. За
показниками ФЕК, отриманими при визначенні вільного і загального
холестерину і за допомогою калібрувального графіку знаходять вміст вільного і
загального холестерину у мкг. Потім за формулою проводять розрахунок
вмісту у сироватці крові вільного і загального холестерину (X) в мМ/л.
94а - маса холестерину ,що знайдена за калібрувальним графіком, мкг;
Робота 7.8
Робота 7.8.1.
Робота 7.8.2.
Робота 7.8.3.
95другої пробірки 1 мл суміші переносять в третю, з третьої — в четверту, й т.д.,
Работа 7.9. Напівкількісний метод визначення ацетонових (кетонових)
тіл в сечі. (Експрес-аналіз)
Для напівкількісного визначення ацетонових тіл в сечі використовують
діагностичні тест-полоски “Cormay Uritest – 1“. При наявності в сечі кетонових
тіл в діапазоні 0,3 – 0,5 мМоль полоска міняє колір, інтенсивність забарвлення
якої зрівнюють з стандартною кольоровою шкалою на футлярі.
Хід роботи. На тест-полоску наносять піпеткою 2 краплі досліджуваної
сечі. Через 2 хвилини колір тест-полоски зрівнюють з стандартною кольоровою
шкалою на футлярі набору. При відсутності ацетону в сечі колір полоски не
змінюється. Наявність ацетонових тіл обумовлює фіолетове забарвлення.
Робота 7.10
Робота 7.11.
96(фосфатидилсерин, кардіоліпіди, фосфатидилетаноламін), які не мають
Робота 7.12.
Робота 7.13.
Робота 7.14.
Робота 7.15.
97Принцип
Клініко-діагностичне значення
Дефіцит жовчі в кишках може бути наслідком хвороб печінки, жовчного
міхура або жовчних шляхів (жовчно-кам’яна хвороба). Супроводжується
порушенням емульгування, травлення і всмоктування ліпідів і жиророзчинних
вітамінів, а також стеатореєю – поява крапель жиру у фекаліях
Робота 7.16.
98
СОД каталізує реакцію знешкодження супероксидного аніон-радикалу
кисню, тобто в організмі є антиоксидантом – речовиною, яка зменшує
активність ПОЛ.
Робота 7.17. Визначення вмісту малонового диальдегіду (МДА)
Принцип
996.Стероїди: загальна характеристика, біологічне значення.
100РОЗДІЛ VIII
1.Історія розвитку ендокринології.
3.Класифікація гормонів за характером дії, хімічною природою, місцем
синтезу.
10120.Антитіла та імуноглобуліни, їх структура та характеристика.
1. Л.М.Вороніна та співавт. “ Біологічна хімія”, Х., Основа , 2000., С.463-533.
Робота 8.1.
Робота 8.1.1.
Принцип. Осадження білка концентрованими мінеральними кислотами
(крім фосфатної кислоти) відбувається в результаті дегідратації білкових
молекул та нейтралізації їх зарядів. Реакція осfдження білка нітратною
кислотою (реакція Геллера) використовується в клінічних дослідженнях сечі на
наявність та кількісний вміст в ній білка за методом Стольнікова.
б)Біуретова реакція
102Хід роботи
Робота 8.1.2.
Робота 8.1.3.
а)Реакція з ферум(III)хлоридом характерна для пірокатехінового ядра, що
входить до складу адреналіну.
Хід роботи. В пробірку вносять 4 краплі розчину адреналіну і 1 краплю
1% розчину ферум(ІІІ)хлориду. Виникає зелене забарвлення.
Робота 8.1.4.
103Робота 8.2.
Робота 8.3.
104підвищується. Інсулін сприяє проникненню глюкози з кров’яного русла через
Робота 8.4.
105В нормі 17-КС – 22,88-81,12 мкмоль/добу.
Робота 8.5.
Робота 8.6
106світлофільтрі. Паралельно обробляють 0,01 мл еталону сечовини так, як і
Робота 8.7
1071000 – перерахунок на мг – еквівалент;
Зниження
Підвищення
Робота 8.8.
1.Поняття про гормони. Історія розвитку ендокринології.
2.Структурна організація ендокринної системи. Поняття про АPUD-систему,
апудоцити.
3.Класифікація гормонів за характером дії, хімічною природою та місцем
синтезу.
4.Характерні ознаки істинних гормонів та гормоноподібних
речовин(гістогормонів). Різновиди ізокринної (місцевої) дії. Представники
гормоноподібних речовин та їх біологічна роль.
5.Регуляція секреції гормонів. Каскадне посилення гормонального сигналу.
6.Типи комунікацій між клітинами та типи механізмів передачі регуляторного
сигналу.
1087.Механізм дії гормонів білково-пептидної природи та катехоламінів (через
рецептори плазматичної мембрани): типи рецепторів плазматичної
мембрани, їх будова; структура та роль G-білків-трансдукторів; каталітичної
ділянки та вторинних посередників (месенджерів): цАМФ, цГМФ, кальцій-
кальмодуліновий та фосфоінозитидні месенджери. Активні форми кисню та
гази як месенджери клітинних сигналів.
109РОЗДІЛ ІX
A.Питання для підготовки з теоретичного матеріалу:
1.Загальна характеристика та структура м’язів.
2.Хімічний склад м’язового волокна: білки м’язів, екстрактивні та мінеральні
речовини.
3.Джерела енергії та енергопостачаючі процеси при м’язовому скороченні.
4.Синтез та біологічне значення креатину та креатинфосфату. Роль
креатинфосфокінази (КФК).
5.Біохімічний механізм м’язового скорочення та розслаблення м’язового
волокна, біохімія м’язової втомлюваності та тренування.
6.Особливості скоротливої функції кардіоміоцитів та гладеньких м’язів.
7.Біохімічні показники патології міокарду та скелетних м’язів. Фармацевтичні
препарати, які використовуються при кардіопатіях та міопатіях.
8.Загальна характеристика та хімічний склад нервової тканини.
9.Особливості обміну речовин в мозковій тканині.
10.Хімічні основи синаптичної передачі, нейромедіатори.
11.Холінергічні та адренергічні синапси.
12.Медіатори та біологічна роль амінокислотних синапсів (серотонінових,
гістамінових, ГАМК, гліцинових, тауринових)
13.Роль пептидних ( опіатних ) та бенздіазепінових рецепторів.
14.Спинномозкова рідина, діагностичне значення її дослідження.
15.Клініко-біохімічні показники патології головного мозку(менінгіт, енцефаліт,
арахноїдит, пухлини). 16.Нейрохімічні механізми дії психотропних засобів.
17.Загальна характеристика, види, будова і біологічна роль сполучної тканини.
18.Характеристика клітинних елементів.
19.Фібронектин, його хімічна структура та біологічна роль.
20.Характеристика волокнистих структур. Хімічний склад та синтез колагену і
еластину.
21.Характеристика та класифікація ферментів деградації колагену.
22.Міжклітинний матрикс, біологічна роль протеогліканів. Представники,
будова та характеристика глікозаміногліканів.
23.Біохімічні показники патології сполучної тканини. Колагенози як
аутоімунні захворювання. Рекомендовані фармпрепарати.
24.Найважливіші функції печінки в підтримці гомеостазу.
25.Біохімічні механізми знешкодження токсичних продуктів: уреогенез, реакції
кон’югації та ін.
26.Клініко-біохімічні показники порушень функціонального стану печінки.
27.Будова та функції нирок. Кліренс.
28.Фізико-хімічні властивості та склад сечі в нормі та при патології.
29.Принципи методів визначення: креатиніну в сечі, церулоплазміну в
сироватці крові, гідроксипроліну у сечі.
110Б. Література
1.Л.М.Вороніна та співавт. “Біологічна хімія”, Х., Основа , 2000., С. 533-555.
4.Я.І.Гонський та співавтори ”Біохімія людини”, Тернопіль, ”Укрмедкнига”,
2002, С. 607-688.
В. Опис лабораторних робіт
Робота 9.1
Робота 9.2
111мітки 10 мл, старанно перемішують. Інтенсивність забарвлення дослідної
Робота 9.3.
112мл дистильованої види (контроль). У всі три пробірки додають по 0,1 мл
Робота 9.4.
113пробірки, в одну вносять 0,5 мл дистильованої води (контроль), а в другу –
Робота 9.5
114Робота 9.6
Робота 9.7
115Гідроксипролін – це амінокислота білків сполучної тканини. У колагені її
Робота 9.8.
Принцип. У сечі здорової людини виділяється 2,7-7,5 мг за добу кислих
глікозаміногліканів (в основному хондроїтин-сульфати А і С). При гаргоїлізмі
й синдромі Гюнтера підвищується виділення глікозаміногліканів із сечею
(мукополісахаридурія) до 30-80 мг.
Глікозаміноглікани з толуїдиновим синім у кислому середовищі дають
червоне забарвлення (метахромазія).
Робота 9.9
Робота 9.9.1. Кількість сечі
Виділення сечі за певний проміжок часу (за день, ніч або за добу)
називають діурезом.
Об'єм сечі вимірюють мірним циліндром за нижнім меніском.
Клініко-діагностичне значення
116В нормі доросла людина за добу виділяє в середньому 1100—1800 мл
сечі. Відхилення від норми називають поліурією, олігурією й анурією.
Поліурія — збільшене виділення сечі (понад 2000 мл) — може бути
фізіологічною (за рахунок вживання великої кількості рідини або внаслідок
нервового збудження) і патологічною (при цукровому і нецукровому діабеті,
захворюваннях нирок, внаслідок приймання сечогінних і серцевих лікарських
засобів).
Олігурія — зменшене виділення сечі (600 мл і менше) — може бути
фізіологічною (внаслідок обмеженого вживання рідини, втрати рідини з потом)
і патологічною (при запаленні нирок, частих проносах, гарячці, блювоті, вадах
серця).
Анурія — повне припинення виділення сечі — часто спостерігається при
закупорці сечоводів (нирковий камінь, пухлина). Таку анурію називають
несправжньою. Справжня анурія виникає при порушенні сечовидільної функції
нирок (гостра ниркова недостатність, важкі форми гострого гломерулонефриту,
отруєння ртуттю (меркурієм), свинцем (плюмбумом).
Ніктурія – збільшення виділення сечі вночі. Зустрічається при
початкових формах серцевої декомпенсації , цистопієлітах.
Робота 9.9.2. Питома вага
В циліндр наливають сечу, занурюють в неї урометр і по нижньому
меніску шкали відмічають результат. В нормі питома вага сечі (густина,
щільність) дорівнює 1,014 – 1,025. За густиною можна вирахувати щільний
залишок, перемноживши дві останні цифри на на коефіцієнт 2,6. В середньому
він дорівнює близько 50г за добу.
Густина сечі характерізує концентраційну здатність нирок, тобто
концентрацію речовин, що в ній розчинені. Густина протягом доби може
змінюватись: нічна сеча має більшу густину ніж денна. Зміни залежать як від
кількості спожитої рідини, так і від кількості рідини, виділеної з потом і калом
( блювота, проноси, гарячка).
При нецукровому діабеті густина сечі зменшується і коливається від
1,001 до 1,004, а при цукровому – досягає 1,030 – 1,040 і більше. Протеїнурія
також збільшує густину сечі.
Виділення протягом тривалого часу сечі зі стабільною густиною (1,010-
1,011) називають ізостенурією ( хвороби нирок).
Робота 9.9.3. Колір сечі
Колір сечі визначають у склянці з безбарвного скла у відбитому світлі на
білому фоні.
Клініко-діагностичне значення
В нормі колір сечі дорослої людини солом'яно-жовтий завдяки таким
пігментам як урохром, уробілін, уроеритрин тощо. У новонароджених сеча
майже безбарвна.
117При патології можуть відбуватися як якісні, так і кількісні зміни у
забарвленні сечі.
Якісні зміни кольору сечі залежать від наявності в ній білірубіну і
гемоглобіну. При гематурії ниркового походження сеча набуває кольору
м'ясних помиїв, при жовтяниці — кольору пива, при вживанні деяких ліків
(амідопірин, ацетилсаліцилова кислота) й отруєнні карболовою кислотою колір
сечі стає рожево-червоним.
Червоний колір сечі спостерігають при порфіринурії. Розрізняють
первинну порфіринурію, що виникає внаслідок ензимопатії, наприклад,
спадкова хвороба Гунтера, при якій із сечею виділяється багато уропорфіринів
і копропорфіринів І типу, та вторинну, яка виникає при інтоксикаціях з
подальшим ураженням печінки.
У разі поліурії (нефросклероз, нецукровий і цукровий діабет, швидке
розсмоктування набряків, тощо) відмічається слабке забарвлення сечі.
Інтенсивне забарвлення спостерігають при олігурії або посиленому виділенні
пігментів, зокрема білірубіну (механічна та паренхіматозна жовтяниці).
Внаслідок вживання буряків, моркви, суниць сеча забарвлюється різними
пігментами, що містяться в цих продуктах.
Молочно-білий колір сечі спостерігають при хілурії внаслідок розриву
лімфатичних капілярів нирки, за наявності великого вмісту ліпідів, фосфатів і
домішок гною.
Робота 9.9.4. Запах сечі
У нормі свіжа сеча має специфічний запах летких речовин, що в ній
містяться. Аміачний запах свіжа сеча має при запаленні сечового міхура
(цистіт), запах гниття — при гангренозних процесах, плодовий або винний, та
запах ацетону — у хворих на цукровий діабет. Запах сечі пов'язаний також із
характером їжі (часник, спаржа) або вживанням деяких медикаментів (запах
валеріани, ментолу тощо).
Робота 9.9.5. Прозорість сечі
Прозорість сечі визначають у склянці з безбарвного скла після
збовтування. У нормі свіжа сеча завжди прозора. З часом у ній починається
лужне бродіння, і сеча стає каламутною. Розрізняють сечу прозору,
слабокаламутну, каламутнувату і різко каламутну.
Причиною каламутності різної інтенсивності може бути наявність у сечі
солей (у лужній сечі фосфатів, а в кислій уратів), слизу, клітинних елементів і
бактеріальної флори (цистопієліт). Дуже рідко каламутність спричинюють
жири (при переломах великих кісток). Щоб відрізнити патологічну
каламутність (осад) сечі від звичайної сольової, треба провести відповідні
хімічні і мікроскопічні дослідження.
118Робота 9.9.6. Хімічне дослідження організованих осадів та їх
відмінність від неорганізованих
Усі елементи сечових осадів поділяють на дві великі групи: організовані
й неорганізовані.
Неорганізований осад складається із солей і кристалічних утворень, що
наявні як у нормальній, так і в патологічній сечі. Солі осаду різноманітні
залежно від реакції сечі.
До неорганізованих елементів осаду в кислій сечі належать аморфні
урати, сечова кислота, оксалати, у лужній — аморфні фосфати, трипель-
фосфати, амонію урати.
До організованих елементів осаду сечі належать усі клітинні елементи:
еритроцити, лейкоцити, епітеліальні клітини (плоскі, циліндричні й круглі).
Хід роботи. У 2 пробірки наливають по 5 мл сечі і додають у першу
пробірку 1 мл 10 % ацетатної кислоти, а в другу — 1 мл 5 % натрій гідроксиду і
нагрівають.
Неорганізовані осади (фосфати, карбонати, оксалати) розчиняються у
кислотах, а урати — в основах. Якщо в лужному середовищі каламуть не
зникає навіть після додавання 3—5 крапель концентрованого розчину натрію
гідроксиду, тоді вона зумовлена наявністю клітинних елементів (епітелій,
лейкоцити, еритроцити, слиз).
Організовані елементи відрізняються від неорганізованих тим, що вони
дуже повільно зсідаються і не розчиняються при нагрівання і додавання
кислот.
Робота 9.9.7. Реакція сечі. Визначення рН сечі за допомогою
індикаторного паперу
Хід роботи. На середину індикаторного папірця "Рифан" наносять 1—2
краплі свіжої сечі й за зміною забарвлення смужки, яка співпадає з кольором
контрольної, визначають рН сечі. Більш точно визначають рН сечі
потенціометричним методом.
Клініко-діагностичне значення
Реакція сечі (рН) у здорової людини коливається в нормі від 4,5 до 8. На
реакцію може впливати характер їжі та патології. Наприклад, лужну реакцію
сечі спостерігають при блювоті, фосфатурїї, запаленні сечового міхура
(цистит) і ниркових мисок (в останніх двох випадках бактеріальна флора
розкладає сечовину на аміак), під час вагітності, вживанні лужних мінеральних
вод. Більш кисла реакція сечі буває при цукровому діабеті та в період
голодування (внаслідок нагромадження у сечі кетонових тіл), при важкій
нирковій недостатності внаслідок порушення функції нирок і зменшення
вмісту аміаку, що нейтралізує сечу. Дуже кислу реакцію спостерігають при
подагрі й гарячці.
Робота 9.10. Титраційна кислотність сечі
119Хід роботи. В колбочку наливають 2 мл сечі, 10 мл води, 2 краплі
фенолфталеїну і титрують 0,1 М р-ном натрій гідроксиду до рожевого
забарвлення. Титраційну кислотність виражають об’ємом лугу, необхідного
для нейтралізації добової кількості сечі. В нормі вона дорівнює 250-500.
Робота 9.11. Визначення азоту амінокислот в сечі
Хід роботи. До нейтралізованої сечі (див.попередню роботу) доливають
3 мл формолової суміші і знову титрують лугом до рожевого забарвлення.
Розраховують азот амінокислот,виходячи з того, що 1 мл натрій гідроксиду
відповідає 0,0014 г азоту. Норма азоту амінокислот в добовій сечі дорівнює 0,3-
0,5 г.
Робота 9.12. Виявлення білка в сечі сульфосаліциловою пробою
Принцип. Для виявлення білка в сечі найчастіше застосовують реакцію
осадження за допомогою сульфосаліцилової кислоти.
Хід роботи. У першу пробірку наливають 2 мл нормальної сечі, у другу
— 2 мл патологічної. В обидві пробірки додають по 5 крапель 20 % розчину
сульфосаліцилової кислоти. За наявності білка в сечі утворюється білий осад
або муть.
Робота 9.13. Виявлення цукру в сечі
Принципи методів якісного виявлення цукру в сечі описані в розділі УІ
"Хімія та обмін вуглеводів".
Хід роботи. Реакції здійснюють після видалення білка із сечі, тому що
він заважає (має редукуючі властивості) виявленню цукру. Для цього до 10—15
мл сечі додають 5—6 крапель 10 % ацетатної кислоти і кип'ятять, а потім осад
відфільтровують. У фільтраті сечі може бути в основному глюкоза або лактоза.
Ці вуглеводи відновлюють оксиди важких металів у лужному середовищі, а в
слабкокислому середовищі відновлює тільки глюкоза. Розрізнити їх можна за
бродінням: глюкоза бродить, а лактоза — ні.
1. Проба Фелінга
Хід роботи. У пробірку вміщують по 10 крапель розчину Фелінга
(купрум сульфату) і лужного розчину сегнетової солі), перемішують, додають
20 крапель сечі, нагрівають до кипіння. За наявності глюкози в сечі випадає
жовтий або червоний осад.
2. Проба Барфуда
Хід роботи. До 2 мл сечі додають 1 мл реактиву Барфуда (купрум ацетат
розчинений в ацетатній кислоті) і нагрівають на водяній бані протягом 5 хв. За
наявності глюкози з'являється осад купрум(І)оксиду.
Ця окисно-відновна реакція відрізняється від інших (Троммера, Ні-
ландера, Фелінга, Бенедикта, реакції срібного дзеркала) тим, що окиснення
моносахаридів відбувається не в лужному середовищі, а в близькому до
нейтрального. У цих умовах дисахариди, що мають відновні властивості (на
120відміну від моносахаридів) не окиснюються. Проба Барфуда з лактозою
негативна.
Робота 9.14. Виявлення крові (бензидинова проба)
Хід роботи. До 3 мл сечі додають 2—3 краплі 3 % розчину гідроген
пероксиду і 2—3 краплі розчину бензидину в ацетатній кислоті. За наявності
крові з'являється синьо-зелене забарвлення.
Клініко-діагностичне значення
Сеча при гематурії каламутна і має червоний відтінок, інтенсивність
якого залежить від кількості форменних елементів крові. В осаді під
мікроскопом виявляють еритроцити і лейкоцити. Гемоглобінурію
спостерігають при захворюваннях, пов'язаних із гемолізом (розпадом)
еритроцитів. Сеча при цьому буває червоного або кавово-бурого кольору. При
гематурії і гемоглобінурії в сечі міститься білок.
Робота 9.15. Виявлення жовчних кислот (проба Петтенкофера)
Принцип. Метод базується на здатності жовчних кислот давати яскраво-
червоне забарвлення з оксиметилфурфуролом, який утворюється внаслідок дії
концентрованої сульфатної кислоти на сахарозу.
Хід роботи. У пробірку наливають 2—3 мл сечі, додають 2 краплі 10 %
розчину сахарози, суміш струшують. Потім обережно по стінці пробірки
нашаровують 1—2 мл сульфатної кислоти. За наявності жовчних кислот
з'являється яскраво-червоне забарвлення на межі двох рідин.
Клініко-діагностичне значення
При механічній жовтяниці внаслідок закупорки загальної жовчної
протоки каменем або пухлиною жовчні капіляри переповнюються жовчю,
гепатоцити стискаються і жовч проникає в кров. У цьому випадку відбувається
посилене виділення жовчних пігментів (білірубін, білівердин) і жовчних
кислот із сечею.
Робота 9.16. Виявлення кетонових тіл (проба Герхарда)
Принцип ґрунтується на здатності ацетоацетату утворювати з
ферум(III)хлоридом сполуку, забарвлену в червоний колір.
Хід роботи. До 5 мл сечі додають по краплях 10 % розчин
ферум(III)хлориду; випадає в осад ферум фосфат. За наявності ацетоацетату
після додавання зайвої краплі ферум(III)хлориду з'являється червоне
забарвлення (реакція на еноли), яке поступово зникає в результаті самовільного
декарбоксилювання ацетоацетатної кислоти:
СН3—СОСН2СООН СН3—CO—СН3 + СО2.
Ацетон
Клініко-діагностичне значення
121У нормі за добу виділяється 20—40 мг кетонових тіл. Збільшення
кількості кетонових тіл у крові (кетонемія) і сечі (кетонурія) спостерігають при
цукровому діабеті, дефіциті вуглеводів у харчуванні (вуглеводне голодува
биохимиятеор
© Copyright: Дмитрий Саврацкий, 2012
Свидетельство о публикации №212101201356
Свидетельство о публикации №212101201356
Рецензии