Сортировка и клонирование клеток текст и перевод

Cell Sorting and Cloning

[0083] The design and construction of the biosensors of this invention resulted in a mixed population of biosensor cells when cultured. Some cells did not express the engineered factors while others expressed the factors at varying levels. Following successful electroporation and gene insertion, biosensor cells were cultured and tested for biological response (flash signal) as mixed populations. Single cell sorting was performed using a Flow Cytometer. Cells were isolated and then expanded for analysis to select those that expressed high levels of the desired proteins. For this process, fluorescently labeled antibodies were used to target different receptors on the biosensor cells, thereby enabling the sorting process. Individual clones were screened for signaling and the best clones were selected. Through this process, the most suitable clones were identified and isolated. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) and live cell staining for extracellular protein was conducted as described below.

[0084] Engineered biosensor cells were counted, gently centrifuged, and re-suspended in wash buffer (HBSS + 2% BSA) to a final concentration of 1x107-1x108 cells/mL. In each experiment, either a full antibody with the Fc region or F(ab)2 was used. When using the full antibody, 1-0.5 µg of Fc receptor blocking antibody was added to each empty 12 x 15 mm tube that was to receive cells.
Into each of these tubes, 100 µL of cells (1x106 to 1x107 cells) was added on top of the Fc blocking antibody. Cells were mixed gently and incubated for 15 minutes at 4°C or room temperature. When using F(ab)2, the previous step of blocking Fc was omitted.  A total of 1 µg of primary antibody (against the receptor of choice) was added, and the cells were then mixed gently before incubating for 20-40 minutes on ice (or at 4°C). This temperature prevented receptor internalization.
Cells were gently agitated (swirled) intermittently to encourage labeling. A 2 mL volume of cold wash buffer was added then cells were centrifuged at 4°C and the supernatant discarded. The wash step was repeated before re-suspending cells in 100 µL of wash/sorting buffer.
A secondary FITC-labeled antibody was added (0.5-1 µg) to the cells and mixed before incubating on ice (or at 4°C) for 20-40 minutes. Cells were protected from light during the entire process. A 2 mL volume of cold wash buffer was added then cells centrifuged and supernatant discarded. The wash step was repeated and cells re-suspend in 0.5-1 mL of wash buffer. Cells were incubated on ice until the time for sorting. Sorting was done as soon as possible (at least on the same day). Cloning and culturing cells after single cell sorting was conducted as described below.

Сортировка и клонирование клеток

Дизайн и конструкция биосенсоров в этом изобретении привели к смешиванию популяции биосенсорных клеток при культивировании. Некоторые клетки не выражали сконструированных факторов, тогда как другие экспрессировали факторы на разных уровнях. После успешной электропорации и инсерции генов биосенсорные клетки культивировали и тестировали на биологический ответ (флэш-сигнал) как смешанные популяции. Одиночные клетки сортировались с использованием проточного цитометра. Клетки изолировали и затем экспандировали для анализа, чтобы выделить те, которые экспрессировали высокие уровни желаемых белков. Для этого процесса использовали флуоресцентно меченные антитела для нацеливания на разные рецепторы на биосенсорных клетках, тем самым обеспечивая процесс сортировки.
Отдельные клоны были подвергнуты скринингу на передачу сигналов, из их числа отобраны лучшие клоны. В процессе этого, наиболее подходящие клоны были идентифицированы и выделены. Ниже описан процессы проведения флуорисцентного сортинга (FACS) и окрашивания живых клеток на внеклеточный белок.

Сконструированные биосенсорные клетки подсчитали, осторожно центрифугировали и повторно суспендировали в промывочном буфере (HBSS + 2% BSA) до конечной концентрации 1;107 - 1;108 клеток/мл. В каждом эксперименте использовали либо полное антитело с Fc-фактором, либо с F (ab)2. При использовании полных антител, в каждую пустую пробирку размером 12 ; 15 мм, предназначенную для приема клеток, добавили 1-0,5 мкг антител, блокирующих Fc-рецептор. В каждую из этих пробирок добавили 100 мкл клеток (от 1х106 до 1х107 клеток) поверх блокирующего антитела Fc. Клетки осторожно перемешали и инкубировали в течение 15 минут при 4°С или комнатной температуре.
При использовании F (ab)2, описанный выше шаг блокировки Fc пропускался.
Всего добавлялось 1 мкг первичного антитела (против выбранного рецептора), после чего клетки осторожно перемешивали перед инкубацией в течение 20-40 минут на льду (или при 4°С). Эта температура препятствует интернализации рецепторов. Клетки осторожно перемешали (путём вращения) для стимулирования маркировки. Добавили 2 мл буфера для холодной промывки, затем клетки центрифугировали при 4°С и слили супернатант. Стадию промывки повторили перед повторным суспендированием клеток в 100 мкл промывочного/сортировочного буфера.
Вторичные FITC-меченные антитела добавили (0,5-1 мкг) к клеткам и перемешали перед инкубацией на льду (или при 4°С) в течение 20-40 минут. Клетки должны быть защищены от света в течение всего процесса. Добавили 2 мл холодного промывочного буфера, после чего клетки центрифугировали и слили супернатант. Стадию промывки повторили и клетки ресуспендировали в 0,5-1 мл промывочного буфера. Клетки инкубировали на льду до момента сортировки. Сортировка должна быть проведена как можно скорее (желательно, в тот же день). Клонирование и культивирование клеток после сортировки отдельных клеток провели, как описано ниже.