Генотипирование

Генотипирование - это определение генотипа чего-то или кого-то живого, например, себя. Для генотипирование надо сначала выделить ДНК, потом эту ДНК размножить или амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции или ПЦР и сделать электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Стадии ПЦР
1. Денатурация ~900C (90 градусов Цельсия).
Затем температура охлаждается до 40–60 C.
2. Отжиг праймеров к последовательности- мишени
3. Удлинение (Taq ДНК полимераза)
Эти три основные стадии составляют один цикл ПЦР, обычно 30-40 циклов необходимо для получения достаточного для анализа количества ДНК. Термоциклеры позволяют программировать стадии ПЦР и циклы.
Для проведения реакции ПЦР необходимо собрать ПЦР смесь. Каждый
отдельный образец отличается только собственной ДНК.
ПЦР смесь - Одинаковые компоненты, такие как буферный раствор, смесь
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, магний (MgCl2), ДНК-полимераза, праймеры, можно смешать в пересчете на все образцы, а затем раскапать по пробиркам для каждого отдельного образца, куда будет добавлена ДНК. Предварительно (для выделения ДНК) наливаем в пробирку объемом полтора два миллилитра SNET-буфер и добавляем протеиназу К. Буфер SNET (400 mMNaCl, 1, 5 mM Na2EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0), добавить 15 мкл протеиназы К (10мг/мл)  . Протеиназа K — сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album. Протеиназа К способна расщеплять кератин, основной белок волос, отсюда и пошло её название.  От исследуемого живого существа или от себя отрезаем маленький кусочек исследуемого живого существа. Помещаем этот маленький кусочек в пробирку с буфером и оставляем эту пробирку в термостате на ночь при температуре пятьдесят пять градусов, чтобы ткань лизировала и белки деградировали. Утром наливаем в эти пробирки 160 микролитров готовой смеси фенола и хлороформ/ изоамилового спирта, хорошо перемешиваем смесь с помощью вортекса, затем центрифугируем десять минут при 14000 оборотах в минуту, но достаточно и 13000 оборотов в минуту. Мешалки Вортекс (Vortex)  предназначены для смешивания жидкостей, помещенных в пробирку, которая вращается и встряхивается специальным механизмом. Используемый тип движения называется орбитальным. Процесс перемешивания может происходить с различной установленной скоростью, равномерно или с ускорениями. Корпус мешалок надежно защищен от химический и механический воздействий. Белки экстрагируют смесью фенола, хлороформа, изоамилового спирта. Поскольку плотности этих органических растворитлей отличны от плотности воды, при центрифугировании лизата клеток, к которому были добавлены фенол и хлороформ, образуется два отдельных слоя: нижний, представляющий собой раствор на основе органических растворителей, и верхний, содержащий водный раствор. При этом белки денатурируют и образуют преципитат, который располагается узкой полосой на границе водной и органической фаз. Если фенол был уравновешени буфером с нейтральным значением рН, то водная фаза будет содержать сразу и ДНК, и РНК. После центрифугирования происходит разделение образца на несколько фаз. ДНК находится в верхней водной фазе. Откуда её аккуратно можно собрать и использовать для проведения ПЦР. После того, как ПЦР прошла Продукты ПЦР анализируем с помощью электрофореза в агарозном геле. ПЦР смесь общим объёмом 24 мкл включает буфер 2,5 мкл; праймеры 1 и 2, ДНК-полимеразу 0,25 мкл; воду 19 мкл; MgCl2 1,5 мкл; dNTPmix 0,5 мкл. dNTP Mix - это смесь высокоочищенных ( чистота более 99%) дезоксирибонуклеотидов четырех типов по 10 mM каждого.  К 24 мкл ПЦР смеси добавляем 1 мкл ДНК пробы. Для приготовления однопроцентного агарозного геля взвешиваем 0,5 грамма агарозы и переносим в колбу и добавляем 50 миллилитров буфера ТАЕ , закрываем пищевой пленкой, чтобы раствор не испарялся и проделываем небольшие отверстия, нагреваем в микроволновке пока раствор не станет прозрачным.  Буфер ТАЕ используют для растворения ДНК или РНК и предотвращения деградации нуклеиновой кислоты. ТАЕ буфера обычно получают в виде 50X маточного раствора для лабораторного применения. Исходный раствор 50X может быть получен путем растворения 242g Tris основания в воде, при добавлении 57.1mL лед ной уксусной кислоты и 100 мл 500 мМ ЭДТА (рН 8,0), раствор, и в результате чего конечный объем до 1 л. Этот исходный раствор может быть разбавлен 49: 1 с водой, чтобы сделать рабочий раствор 1X. Это решение будет содержать 1X 40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА. Мы используем специальную подставку для заливки геля, добавляем в гель 5 микролитров раствора красителя для ДНК - гель РЭД.
Краситель Gel Red более чувствителен и менее токсичен, чем бромистый этидий, окрашивает дцДНК, оцДНК или РНК в агарозном геле. Исходный раствор тысячекратный перемешиваем, выливаем раствор в специальный столик для геля. Когда гель застыл вынимаем гребенку и переносим гель, не вынимая подставки, в объём  для проведения электрофореза в который налит буфер ТАЕ. При необходимости доливаем ещё буфер, чтобы карманы геля оказались полностью покрыты жидкостью. Наносим пробы в карманы. Электрофорез проводим при напряжении от  100 до 120 вольт. Результаты анализируем на трансиллюминаторе.