КЛОН 2

 
Введение

 

Клонирование — это появление естественным путём или искусственное получение нескольких генетически идентичных организмов и/или их клеток путём бесполого  размножения или партеногенеза. Клонирование – это способ бесполого размножения, при котором новорожденный получает все гены от клетки одного индивидуума. Клон – совокупность клеток или организмов, генетически идентичных одной родоночальной клетке, группа клеток, которые содержат одинаковую молекулу рекомбинантной ДНК.

Опыты по клонированию млекопитающих начались в середине 1970-х годов. В 1975 проведено клонирование кроликов с пересадкой ядер эмбриональных стволовых клеток.

Затем было опубликовано знаменитое сообщение о рождении овцы Долли,  которая появилась на свет 5 июля 1996 года в Шотландии путем клонирования при помощи пересадки ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer – SCNT).

Следует различать перенос ядра эмбриональной клетки в энуклеированную яйцеклетку и  перенос ядра соматической клетки взрослого организма. Классическим методом получения идентичных генотипов у зародышей млекопитающих является дисекция эмбрионов на стадии морулы или бластоцисты или микрохирургическое деление эмбрионов. Бластомеры в самом начале  деления зиготы тотипотентны, то есть способны восстановить целый организм. Далее, после ранних стадий эмбриогенеза, эта тотипотентность постепенно уменьшается до плюрипотентности, когда клетка может развиваться в любую клетку организма, но не в целый организм,  и, наконец, до мультипотентности, когда клетка может развиваться в один или небольшое число типов клеток. Яйцеклетки и сперматозоиды – это высокодифференцированные клетки, геном которых настроен на выполнение определенных функций, включая и тотипотентность в развитии.  Причем следует отметить, что клетки, из которых образуются гаметы, такой тотипотентности не имеют.

Появление овечки Долли стало настоящим прорывом в клеточных технологиях, революцией в генной инженерии. На сегодняшний день проблема клонирования млекопитающих является одной из самых актуальных в мировой науке. Метод клонирования возник в результате исследований по доказательству того, что ядра зрелых клеток содержат всю информацию необходимую для кодирования всех признаков организма. Специализация каждой клетки обусловлена началом или прекращением функционирования определённых генов.

Темпы развития клонирования превосходят самые смелые прогнозы. Клонирование имеет как фундаментальное, так и большое прикладное значение, открывая новые перспективы не только в биологии, сельском хозяйстве, но и в медицине. Развитие технологии клонирования позволяет ускорить понимание таких проблем, как онтогенез и старение организма, и получить новые данные о сущности злокачественной трансформации.

Среди возможных медицинских приложений методов клонирования – производство белков, необходимых для лечения различных болезней, получение клеточных клонов, способных дифференцироваться в любую из тканей, для клеточной терапии ряда заболеваний человека, являющихся следствием повреждения определенной клеточной популяции; не исключено создание трансгенных животных, например свиней – доноров органов (сердце, печень, почки) для трансплантации их человеку.

         

Глава 1. Способы и методы клонирования (общетеоретические основы изучения методов и приёмов клонирования)

1.1. Клонирование – способ создания новых организмов

 

                В основе технологии клонирования, так или иначе, лежит способность клетки развиваться только с материнским диплоидным набором хромосом. Заставить клетку развивать такую способность можно двумя способами: хирургическим и терапевтическим. Хронологически второй метод изобретён намного раньше. Сто лет назад зоолог Московского университета А. Тихомиров доказал, что яйца тутового шелкопряда под воздействием различных химических и физических реакций могут развиваться без оплодотворения. Такое развитие было названо партеногенезом. Клонировать млекопитающих можно, как упоминалось, и другим способом – хирургическим. Он основан на замене гаплоидного ядра яйцеклетки на диплоидное ядро, взятое из клеток эмбрионов. Эти клетки ещё не дифференцированы, то есть не началась закладка органов, поэтому их ядра легко заменяют функцию диплоидного ядра только что оплодотворённой клети. Таким методом в США в 1952 г. У. Р. Бриггс и Т. Дж. Кинг, и в Англии Д. Б. Гёрдон в 1960 г. получили генетические копии лягушки, а в 1996 году шотландец  И. Уилмут получил хирургическим путём знаменитую овцу Долли - генетическую копию матери.

Технология хирургического клонирования состоит в том, что из яйцеклетки при помощи микрохирургической операции удаляется ядро и вместо него вводится ядро соматической клетки другой особи

         

 (донора), где содержатся гены только донорского организма. Сущность данной технологии – это энуклеация яйцеклетки или зиготы и введение в неё генома соматической клетки от донора.

         Экспериментальная стратегия, использованная для получения овцы Долли, представлена на. Согласно этой стратегии подготовка клеток-доноров ядер путем культивирования в среде, лишенной сыворотки, приводит к остановке клеточного цикла и переходу клеток из стадии G1 в стадию покоя G0, в которой клетки не делятся. Перенос ядер при клонировании овцы Долли осуществляли с помощь слияния клеток (а не инъекции ядер).

 

Ученые из университета штата Висконсин опробовали другую методику клонирования млекопитающих, отличную от той, что применялась учеными из Рослинского института, вырастившими овцу Долли . Они в качестве основного исходного материала использовали яйцеклетки коровы, у которых генетический материал заменяли на молекулы ДНК других клонируемых животных - свиньи, крысы, овцы или кролика. При этом источником наследственного материала служили клетки тканей взрослых особей, взятые,  например, из свиного или крысиного уха. После искусственного оплодотворения из коровьих яйцеклеток, получивших новую генетическую информацию, развивались зародыши других млекопитающих - копий генетических доноров. Таким методом  ученым удалось благополучно вырастить в лабораторных условиях эмбрионы овцы, коровы, мыши, свиньи, кошки, кролика, крысы, собаки, хорька, буйвола, верблюда.

Первое в мире успешное клонирование приматов удалось практически осуществить выпускнику Российского государственного аграрного университета имени К.А. Тимирязева Шухрату Музапаровичу Миталипову, который с 1995 года работает в штате Орегон (США), где не запрещено клонирование животных.

Первая лаборатория клонирования человека Clonaid была открыта в начале 2001 в США (см. http://www.clonaid.com/). Однако, заявления Clonaid об успешном клонировании человека вызывают сомнения, так как Clonaid отказывается предоставить доступ к их предполагаемым клонированным младенцам для сравнительного анализа ДНК любого из этих младенцев и донора.

               

 

 1.2. Репродуктивное и терапевтическое клонирование

 

В настоящее время выделяют два основных вида  клонирования: репродуктивное и терапевтическое. В результате репродуктивного клонирования образуется новый целостный организм, который является генетической копией другого организма – клон. Терапевтическое клонирование – это технология клонирования с целью получения эмбриональных стволовых (ЭС) клеток для научных исследований и использования в терапии различных заболеваний человека. В процессе терапевтического клонирования эмбрион не переносится для дальнейшего развития в полость матки, а используется в качестве объекта научных исследований и получения стволовых клеток (СК).

Зигота является тотипотентной, т.е. из бластомеров могут при соответствующих условиях развиться зародыши. На стадии  бластоцисты образуются плюрипотентные клетки, из которых в дальнейшем формируются все органы и ткани организма. В процессе терапевтического клонирования эмбрион неизбежно уничтожается после образования первичной «полоски» («ствола») клеток, т.к. их дальнейшее развитие происходит в различных условиях искусственной среды в соответствии с тем, какую ткань предполагается получить. Технология репродуктивного клонирования широко применяется в исследовательских целях на животных. К настоящему времени накоплен обширный опыт по клонированию животных разных видов (грызуны, кошки, кролики, свиньи, телята и др.). Наиболее перспективным направлением в клеточной инженерии является клонирование животных с использованием методов генной инженерии. Введение в эмбрион новой ДНК позволяет получать животных с новыми свойствами их организмов. Эти свойства могут быть использованы в медицине для лечения различных заболеваний, трансплантации, в фармацевтической и пищевой промышленности. Например, в 1997 г. биотехнологическая компания PPL Therapeutics Inc. совместно с Рослинским институтом клонировала овцу по кличке Поли из генетически измененной зародышевой клетки. Молоко клонированного животного содержало белок, вызывающий свертывание крови человека, который может быть использован для лечения гемофилии.

 

 

В биологии клон — это набор генетически идентичных друг другу особей, произошедших из одного предшественника. Самым простым типом клонирования является клонирование клеток. Таким образом, можно выделить из кожи одну эпидермальную стволовую клетку, позволить ей расти и делиться в культуре и в результате получить большой клон генетически идентичных эпидермальных клеток. Их можно затем использовать для восстановления кожного покрова пациентов с тяжелыми ожогами. Такого рода клонирование является искусственным усилением процессов клеточной пролиферации и заживления, происходящих в человеческом теле в нормальных условиях.

Клонирование целых многоклеточных организмов — репродуктивное клонирование — это совершенно другой процесс. При репродуктивном клонировании отпадает необходимость наличия двух родителей и сексуального союза для зарождения жизни. В случае млекопитающих выдающиеся результаты достигнуты на овцах и других домашних животных при помощи трансплантации ядер соматических клеток. Процедура начинается с неоплодотворенной яйцеклетки. Из этой гаплоидной клетки удаляют ядро и заменяют его ядром обычной диплоидной соматической клетки. Диплоидную донорскую клетку обычно извлекают из ткани взрослой особи. Гибридная клетка, состоящая из диплоидного донорского ядра и цитоплазмы яйцеклетки-реципиента, некоторое время развивается в культуре. В небольшом количестве случаев происходит формирование эмбриона, который затем помещают в матку суррогатной матери. Если развитие зародыша пойдет нормально, то, в конце концов, родится новое животное. Полученная таким образом, при помощи репродуктивного клонирования, особь будет генетически идентична взрослой особи, служившей донором диплоидной клетки (за исключением заключенной в митохондриях генетической информации, которая наследуется исключительно из цитоплазмы яйцеклетки).

Большое значение для успеха клонирования овцы Долли имело то, что при клонировании были синхронизированы стадии клеточного цикла энуклиированных ооцитов-реципиентов и клеток-доноров. Было установлено, что лучше пересаживать ядра донорских клеток, находящиеся на стадии G0, в энуклиированные ооциты на стадии метафазы II, поскольку слияние цитопласта с кариопластом активирует дробление образованной в результате такого слияния клетки.

Первые успешные опыты по клонированию показали, что соматическое ядро в цитопласте подвергается репрограммированию – процессу переориентирования донорского генома на синтез белков, соответствующих эмбриональному развитию. В результате  репрограммирования становятся активными те участки хромосом, которые усиленно работают у раннего зародыша, и ядро приобретает способность инициировать развитие целого организма  . Молекулярные механизмы репрограммирования ядра очень сложны и до сих пор остаются неясными. Наблюдения последних лет показывают, что репрограммирование начинается сразу же после введения донорского ядра в цитопласт и продолжается после дробления, возможно до гаструляции.

Многочисленные исследования показали, что ооциты во время второго мейотического деления имеют в своей цитоплазме факторы, вызывающие репрограммирование ядра. Природа этих факторов в клетках млекопитающих до сих пор точно не определена.

У донорских ядер, перенесенных в цитопласты, происходит

разрушение ядерной оболочки и преждевременная конденсация хромосом (premature chromosome condensation, PCC. PCC способствует эффективному репрограммированию ядра и экспрессии генов, ответственных за эмбриональное и постэмбриональное развитие . Эти события вызывает MPF (фактор, стимулирующий митоз – mitosis promotion factor), активность которого в ооците во время второго мейотического деления высока. Предполагается, что в клетке MPF связан с веретеном деления. Поэтому при энуклеации вместе с метафазарной пластинкой из яйцеклетки удаляется значительное количество MPF. Это может объяснить различия в поведении донорских ядер после введения их в цитопласт, даже если цитопласты получены из ооцитов одного животного. Снижение активности MPF после энуклеации зависит и от вида животных. Так в цитопластах свиней какого либо снижения активности MPF после энуклеации не наблюдалось.

Установили, что белок FRGY2 из ооцитов Xenopus

может вызывать обратимое разрушение оболочки ядра, но становится ли ядро соматической клетки тотипотентным под влиянием FRGY2 не известно. Таким образом, события, происходящие сразу после переноса ядра, являются предпосылкой для всего дальнейшего развития эмбриона. Определив эти параметры, можно улучшить процесс репрограммирования и, как следствие, улучшить эффективность клонирования в целом.

Терапевтическое клонирование значительно отличается от репродуктивного. В этом случае метод трансплантации ядер соматических клеток применяют для создания персональных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Здесь эмбрион на очень ранней стадии развития, состоящий из примерно 200 клеток, не переносится в матку суррогатной матери. Вместо этого его хранят в культуре и используют в качестве источника ЭС клеток с целью их дифференцировки в различные типы клеток, которые можно будет применять для восстановления тканей. Полученные таким путем клетки генетически практически идентичны донору исходного ядра, поэтому их можно трансплантировать обратно в донора без риска иммунологической реакции.

Трансплантация ядер соматических клеток потенциально имеет еще одно достоинство — она может позволить изучать наследственные заболевания человека. ЭС клетки, получившие соматическое ядро от особи с наследственным заболеванием, могут позволить напрямую исследовать развитие заболевания по мере дифференцировки их в различные типы клеток. «Болезнеспецифические» ЭС клетки и их дифференцированных потомков также можно использовать для разработки и тестирования новых лекарств.

 

1.3. Эмбриональные клоны

Идентичные двойни, тройни или четверни, полученные разделением одного исходного эмбриона на соответствующее число частей, по праву могут быть названы клонами, хотя и малочисленными, ибо они представляют популяцию генетически однородных организмов, развившихся из единственной клетки-предшественницы – зиготы. Возможность получения эмбриональных клонов в животноводстве фактически была доказана ещё классическим опытом F. Seidel, получившего двух кроликов, каждый из которых развился из единственного бластомера. Первый в мире эмбриональный клон телят был получен в 1981 г.. Эмбрионы на стадии восьми бластомеров были собраны хирургическим путем от телок на третий день эстрального цикла . Разьединенные бластомеры были заключены в пустые блестящие оболочки (zona pellucida (ZP)) свиньи, затем в агар с последующим культивированием в перевязанных яйцеводах промежуточного рецепиента (анэстральной овцы) в течение 90 ч. Все эмбрионы, продолжившие нормальное развитие, были трансплантированы на стадии ранней бластоцисты в матку телок рецепиентов хирургическим путем на седьмой день цикла. В итоге родились одна монозиготная тройня и две пары монозиготных двоен телят. Микроманипуляции с поздними эмбрионами имеют то преимущество, что со стадии ранней бластоцисты  они уже не требуют наличия ZP при трансплантации, тогда как более ранние эмбрионы без нее погибают.  Метод получения эмбриональных клонов включает в наиболее полном варианте следующие технические приемы: вымывание эмбрионов, освобождение их от ZP, разъединение бластомеров (или разделение пополам клеточной массы морулы или бластоцисты), заключение одиночных бластомеров в ZP, затем агар и трансплантация их промежуточному реципиенту, освобождение от агара и контроль качества эмбрионов после развития в яйцеводах промежуточного рецепиента и, наконец, трансплантация полуэмбрионов окончательному реципиенту.

Эмбрионы 2- и 4- клеточных стадий развития извлекаются при помощи пипетки с тонко заточенным концом, которую вводят не далее, чем в середину эмбриона, что вызывает дезагрегацию эмбриона на отдельные бластомеры. Восьмиклеточные эмбрионы нельзя дезагрегировать подобным способом, поскольку происходит процесс компактизации бластомеров, когда бластомеры теснее прилегают друг к другу и теряют округлые формы. Главное условие компактизации – наличие в среде ионов Ca2+  и Mg2+ . Для получения отдельных бластомеров от 8-клеточных эмбрионов проводят их инкубацию в среде, не содержащей ионов Ca2+  и Mg2+ в течение 15 – 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Дополнительно в культивируемую среду добавляют ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту), которая способна связывать ионы Ca2+  и Mg2+ . Другим, более сложным способом получения изолированных бластомеров является их отсасывание при помощи микропипетки, введенной через зону пеллюцида целого эмбриона . Такой метод применяется на 4-16-клеточной стадии развития эмбриона, который инкубируется в безкальциевой среде с добавлением цитохалазина В (10мг/мл) или Д (1мг/мл). Этот метод чаще применяется для биопсии эмбрионов или (реже) для получения бластомеров – доноров ядер в исследованиях по трансплантации клеточных ядер. Культивирование изолированных бластомеров проводится in-vitro до момента образования компактной морулы или бластоцисты, которые затем могут быть пересажены в организм рецепиента. Данная методика клонирования наиболее разработана для таких видов млекопитающих, как мышь, кролик, овца, крупный рогатый скот.

Эмбриональные клоны являются бесценным материалом для биологических исследований, так как они повышают точность и достоверность результатов исследований типа контроль – опыт. Одновременно решается проблема содержания обширных групп аналогов, что может иметь существенный экономический эффект,

когда речь идет о сельскохозяйственных животных.

 

Однояйцевые близнецы могут быть использованы для оценки изменений фенотипа, обусловленных факторами внешней среды и генетическими перестройками, для исследования гетерозиса (увеличения жизнеспособности гибридов вследствие унаследования определенного набора аллелей различных генов от своих разнородных родителей), инбриндинга (концентрации идентичных по происхождению аллелей генов в составе одного генотипа, то есть у одного организма) и выявления рецессивных летальных генов.   

Для биолога представляет интерес исследование разновозрастных генетически идентичных близнецов, датированное получение которых достижимо путем эмбрионального клонирования при замораживании частей эмбриона и последующей их трансплантации реципиенту в разное время. Генетически идентичные организмы, рожденные через большие промежутки времени могут использоваться, например, для изучения природы старения, а также в качестве доноров клеток для рождённых ранее их генетических копий.

 

 

Глава II. Дефекты клонирования

2.1. Генетические дефекты клонирования

         Митохондриальная ДНК  (мтДНК) может содержать различные мутации или перестройки. Существует вероятность переноса при клонировании мутантной мтДНК от клетки донора. Это может привести к дисфункции митохондрий и болезни клонированного организма. В настоящее время более десятка заболеваний человека связаны с мутациями в митохондриальном геноме . Перенос мтДНК от отцовского организма возможен и при нормальном оплодотворении, но при этом отцовские мтДНК быстро разрушаются сразу после оплодотворения. При использовании для клонирования таких технологий как слияние энуклеированной яйцеклетки и клетки донора, перенос ядра, вероятность переноса отцовских митохондрий в эмбрион резко возрастает. В связи с этим необходимо исследовать роль гетероплазмиии мтДНК  при клонировании модельных животных. Дополнительным требованием может стать  также анализ ооцитов-доноров на присутствие мутаций в мтДНК .

Репродуктивное клонирование позволяет подбирать различные  сочетания ядерного и митохондриального генотипов, поскольку в результате такого клонирования фактически получаются химерные организмы. У овцы Долли и других животных, полученных при ядерном переносе, митохондриальная ДНК принадлежала реципиентным энуклиированным ооцитам с некоторым вкладом от соответствующих донорских клеток. То есть большинство ядерных клонов все-таки представляют собой генетические химеры с ядерной ДНК клетки-донора и митохондриальной ДНК реципиентных ооцитов. В реконструированном эмбрионе митохондриальная ДНК клетки-донора достаточно быстро исчезает (частично или полностью) уже на ранних стадиях эмбриогенеза.

При сравнительном анализе экспрессии генов у эмбрионов, полученных методом  SCNT и при экстракорпоральном оплодотворении ооцитов обнаружены множественные отклонения по генам, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, внутриклеточном транспорте, протеолизе и клеточной адгезии, что лежит в основе различных патологий развития у клонированных эмбрионов.

Дефекты репрограммирования генетического аппарата считаются основной причиной низкой эффективности клонирования посредством трансплантации ядер соматических клеток в энуклиированные яйцеклетки.

 

2.2. Эпигенетические дефекты клонирования

Нарушение ядерного и эпигенетического репрограммирования генома ядра-донора может пагубно отразиться на развитии клонированного организма. Эпигенетическое репрограммирование происходит в  зародышевых клетках во время оплодотворения, а также во время процедуры клонирования при переносе ядра клетки-донора в энуклеированный ооцит. Для клонированных эмбрионов характерно нарушение метилирования ДНК, ацетилирования гистонов, изменение характера инактивации Х-хромосомы, а также дефекты импринтинга.

В связи с использованием при клонировании ядер соматических клеток возникает вопрос о длине теломерных участков хромосом у клонов. Теломеры на концах хромосом млекопитающих представляют собой повторы (TTAGGG)n.  Систематические потери теломерных последовательностей в размере 50-200 пар нуклеотидов при каждом деление клетки могут приводить к ускоренному старению клонированного организма. Достигая критически малой длины, теломера утрачивает способность защищать концы хромосом от межхромосомных слияний, что может привести к разрушению генетического аппарата клетки. Некоторые клетки благодаря работе фермента теломеразы способны заново синтезировать копии TTAGGG-последовательности и восстанавливать длину теломер. Однако, в большинстве соматических клетках активность теломеразы не обнаруживается.

Сравнение длины теломер у овцы Долли, клонированной путем переноса ядра соматической клетки от 6-летней овцы, а также клонов полученных при трансплантации ядер клеток 9-суточного эмбриона и 25-суточного плода с контрольными животными того же возраста показало, что у всех клонированных животных длина теломер была меньше (у Доли в возрасте 1 год – на 20% короче).   

Хотя и показано, что эпигенетические дефекты могут приводить к изменению длины теломер у потомства, связи между длиной теломер и выживаемостью клонированного потомства доказано не было.

Большинство аномалий у клонируемых эмбрионов обусловлены более быстрым ростом плода и плаценты, получившим название синдрома крупных потомков (large offspring syndrome – LOS).

При сравнении развития эмбрионов крупного рогатого скота, полученных в результате искусственного осеменения (AI),  оплодотворения in vitro (IVF) и методом SCNT в качестве маркера репрограммирования рассматривали метилирование CpG сайтов в альфа-сателлите ДНК .  Повышенный уровень метилирования в бластоцистах в варианте с SCNT и в последующем в соматических тканях этих эмбрионов может быть обусловлен либо тем, что соответствующие изменения ещё не успели произойти, либо отсутствием такого количества специфических факторов в цитопластах ооцитов, которое необходимо для полноценного репрограммирования хроматина соматических клеток.

 

Полагают, что успешность клонирования определяется процессом репрограммирования трансплантированного ядра, которое связано с метилированием и деметилированием ДНК, регулирующим генную экспрессию, и изменением организации хроматина, происходящим после ядерного переноса во время первых клеточных делений.  В доимплантационных эмбрионах происходит геномное стирание метилирования, а после имплантации и дифференциации паттерны метилирования восстанавливаются. Именно в период сброса паттернов метилирования ДНК у эмбрионов наступает период развития, который особенно чувствителен к воздействию окружающей среды.

Глава 3. Биотехнические и правовые вопросы клонирования

3.1. Временный запрет на клонирование человека

 

Возможности использования технологий терапевтического и репродуктивного клонирования выявили целый ряд этико-философских, социально - правовых и других проблем, связанных со спецификой каждого из этих видов клонирования. 

Применение технологии репродуктивного клонирования на человеке вызвало наибольшее количество возражений, споров и дискуссий различного уровня и направлений. Эксперименты по клонированию эмбрионов человека перевели проблему клонирования из области биомедицины в область этико-правовых, социально-политических и религиозных проблем мирового значения. В настоящее время перспектива клонирования человека рассматривается как потенциальная угроза для самобытности человека, как в телесном, так и в духовно-психологическом плане. Правовой аспект проблемы клонирования нашел широкое отражение в ряде международных и государственных документов многих стран. На международном уровне проблема репродуктивного клонирования человека рассматривалась несколькими специализированными учреждениями системы Организации Объединенных Наций (ООН). Во Всеобщей Декларации о геноме человека и правах человека в области биомедицины (ВМА), принятой в 1997 г. и одобренной Ассамблеей ООН в 1998 г., провозглашено, что геном человека «знаменует собой достояние человечества» и признается «неотъемлемое достоинство и разнообразие» всех представителей человеческого рода. В данном документе клонирование человека признается противоречащим человеческому достоинству. В разделе «Исследования, касающиеся генома человека» сказано: «Не допускается практика, противоречащая человеческому достоинству, такая, как практика клонирования в целях воспроизводства человеческой особи». Федеральный закон "О временном запрете на клонирование человека" (см. приложение) вводит временный запрет на клонирование человека, исходя из принципов уважения человека, признания ценности личности, необходимости защиты прав и свобод человека и учитывая недостаточно изученные биологические и социальные последствия клонирования человека.

С учетом перспективы использования имеющихся и разрабатываемых технологий клонирования организмов предусматривается возможность продления запрета на клонирование человека или его отмены по мере накопления научных знаний в данной области, определения моральных, социальных и этических норм при использовании технологий клонирования человека.

 

3.2. Рождение близнецов – естественное клонирование

 

Создание человека, генетически идентичного другому человеку может происходить естественным путем при рождении близнецов.  Как крупное долгоживущее млекопитающее, человек имеет низкую плодовитость. Обычно беременность завершается рождением одного ребенка. Если же в результате беременности рождается двое и более детей, их называют близнецами. Детеныши-близнецы могут рождаться и у животных, таких как крупные хищники и обезьяны.

С древнейших времен людей удивляло, что в одних случаях

близнецы рождались однополыми, и очень похожими друг на друга, а в других – сходство было не больше, чем между обычными братьями (сестрами) или же дети рождались разнополыми. Причина таких различий кроется в разном механизме формирования близнецов. Близнецов делят на две группы: однояйцевые (монозиготные, идентичные) и двуяйцевые (дизиготные, братские).

Двуяйцевые возникают в результате двух, произошедших в

рамках одного полового цикла, независимых зачатий. В редких

случаях, таким образом могут быть оплодотворены от четырех до

восьми яйцеклеток. Родившиеся дети могут быть разнополыми, и, по

сути дела, они являются обычными братьями и сестрами. Частота

рождения двуяйцевых близнецов увеличивается с возрастом матери и к 35 годам достигает 0,7-0,8 % .

Однояйцевые близнецы развиваются из обособившихся частей

одного доимплантационного зародыша. Обычно зародыш делится на две части, но описаны случаи появления на свет четырех и шести идентичных близнецов.

В случае парной близнецовости у 33 % пар каждый из

зародышей имеет независимый хорион. Это значит, что разделение единого зародыша произошло до формирования трофобласта, то есть ранее 5 суток беременности. Бластомеры 

 

 

зародышей, начиная с двуклеточной стадии, и до времени компактизации морулы могут разделиться и сформировать две клеточные группы внутри одной блестящей оболочки. Из них образуются две бластоцисты, которые после вылупления будут независимо друг от друга имплантироваться и формировать все внезародышевые оболочки.

Во время кавитации бластоцисты внутриклеточная масса (ВКМ) также может разделиться на две части. Так появляются примерно 2/3 идентичных близнецов. Если части ВКМ оказались на большом  расстоянии друг от друга, то зародыши-близнецы будут иметь один общий хорион и две индивидуальных амниотических оболочки. Если такие группы клеток ВКМ примыкают друг к другу, то развивающиеся из них зародыши будут иметь общие хорион и амнион. Неполное разделение ВКМ может привести к формированию неправильно развивающихся зародышей и появлению так называемых двойниковых уродств, к числу которых относятся «сиамские близнецы». Возникновение близнецов наглядно иллюстрирует удивительную способность к регуляции развития, которой обладают тотипотентные бластомеры дробящегося зародыша и плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты.

Развитие однояйцевых близнецов начинается с одной яйцеклетки оплодотворенной одним сперматозоидом. Начальные этапы эмбриогенеза протекают как обычно, но в какой-то момент клетки зародыша разделяются на две или больше равных либо неравных части. При благоприятном стечении обстоятельств каждый из образовавшихся клеточных конгломератов может продолжить нормальный эмбриогенез, который завершится появлением на свет монозиготных близнецов. Вспомним, что млекопитающие относятся к организмам, для которых характерно регуляционное развитие. Естественно, что такие близнецы всегда будут не только одного пола, но и генетически идентичными. Например, трансплантация тканей от одного монозиготного близнеца другому проходит без иммунологических осложнений.

Причины разделения одного зародыша на части в естественных условиях остаются непонятными, но вызвать подобное явление в экспериментальных условиях — механическими или химическими воздействиями — задача не очень сложная. Стадию развития, на которой произошло образование монозиготных близнецов, можно с той или иной степенью точности определить по косвенным признакам. Так, примерно в трети случаев каждый из таких близнецов имеет полноценный независимый хорион. Это означает, что разделение бластомеров произошло до появления трофобласта, т.е. в первые 5 суток развития. У двух третей близнецов имеется общий хорион, но в подавляющем большинстве случаев — разные амнионы. Здесь можно предположить, что разделение ВКМ произошло в период между пятыми и девятыми (когда начинает формироваться амнион) сутками развития. Наблюдались случай формирования трихориальной пятиамниональной пятиплодной беременности после переноса 2 эмбрионов на 4-й день развития, которым на 3 день развития была проведена биопсия бластомеров для преимплантационной генетической диагностики. Незначительное количество близнецов имеет общий хорион и амнион, что указывает на разделение после девятого дня. Такое позднее разделение может оказаться неполным, и это приведет к возникновению сросшихся, «сиамских» близнецов. Полагают, что крайним сроком, когда еще возможно образование монозиготных близнецов, являются 12-14-й дни развития.

 

 

3.3. Способы манипулирования клетками при клонировании

Ключевым этапом клонирования является удаление генома ооцитов или зигот с целью последующего введения донорских ядер. В начале появления технологии клонирования использовали различные варианты механической энуклеации. В последующем стали также использовать химическую энуклеацию. Однако,  эффективность клонирования остается весьма низкой, в том числе из-за этапа энуклеации, поскольку механческое инвазивное извлечение ядра неизбежно связано с уменьшением объема цитопласта и, вероятно, вследствие этого, со снижением его репрограммирующей способности, а при химической энуклеации ооциты и зиготы подвергаются воздействию токсических веществ, что также может приводить к снижению их жизнеспособности .  Была показана возможность эффективной замены механической и химической энуклеации неинвазивным воздействием лазера на ядро без повреждающего воздействия на другие органеллы клетки. При этом были определены необходимые параметры интенсивности и длительности воздействия лазерного импульса, точки фокусировки при энуклеации. Полученные данные открывают новые возможности использования лазера в исследованиях по клонированию млекопитающих, что актуально для различных биомедицинских направлений, в том числе связанных с регенеративной медициной.

Процесс энуклеации с помощью механической микрохирургии связан с инвазивным воздействием на зародышевые клетки.  При механическом извлечении генетического материала из зиготы происходит травмирующее деление клетки на цитопласт и кариопласт. В то же время энуклеация лазером является неинвазивным воздействием с сохранением всего объема и целостности клетки.   

Было показано что  все ключевые этапы: энуклеацию ооцита, перенос соматической клетки (кариопласта) под зону пеллюцида ооцита, слияние энуклиированного ооцита и  соматической клетки можно эффективно выполнять с помощью лазера, полностью заменив им механические микроманипуляторы и другие устройства, в том числе для электрослияния. Результаты свидетельствуют о перспективности применения лазера в современной клеточной инженерии для работ с зародышевыми клетками, и особенно в технологиях терапевтического и репродуктивного клонирования. Существенно, что лазерное слияние не требует применения специальных средств и наблюдается в обычной стандартной среде для манипуляций с зародышами.  Показано, что электрослияние приводит к значительным изменениям внутриклеточного ионного гомеостаза у реконструированных зародышей, вероятно, вследствие электропробоя всей поверхности мембраны, в то же время при слиянии лазером луч действует на мембрану в узкой области фокусировки и при этом вряд ли возможно серьезное нарушение ионного гомеостаза клетки.

Лазер использовали на всех этапах пересадки ядер у млекопитающих: манипуляции по энуклеации ооцитов, переносу соматических клеток (кариопластов) под оболочку (zona pellucida) цитопластов и их плотному сближению, слияние цитопластов и соматических клеток с помощью лазера Tsunami. Эксперименты проводили следующим образом . Активированные ооциты на стадии пронуклеуса энуклиировали однократным облучением лазерным импульсом мощностью 0,1-0,3 Вт и длительностью 0,3 с, сфокусированным на проядрышко. Сразу после энуклеации использовали полупроводниковый лазерный модуль для перфорации блестящей оболочки. Локальный участок зоны пеллюцида облучали лазерным импульсом мощностью 240-300 мВт и длительностью 800-1000 мкс. Диаметр полученного отверстия составлял 12-15 мкм. Затем проводили лазерный захват  и перемещение соматической (кумулюсной) клетки диаметром 7-9 мкм под блестящую оболочку энуклиированного ооцита с помощью лазера  при непрерывном режиме излучения и мощностях до 20-30 мВт. Весь этап по захвату и перемещению кумулюсной клетки под оболочку ооцита занимал 1-3 мин. Вслед за этим проводили лазерное слияние соматической клетки с энуклиированным ооцитом. Клетку кумулюса, по возможности, плотно прижимали к ооциту с помощью лазерного захвата и достигали тем самым контакта, необходимого для слияния. Далее лазерным импульсом мощностью 0,1-0,3 Вт и продолжительностью 0,02 с облучали визуально отобранную точку на линии наиболее плотного контакта и вскоре наблюдали слияние энуклиированного ооцита и кумулюсной клетки. При последующем культивировании in vitro ооцитов, слившихся с соматическими (кумулюсными) клетками, никаких разрушений вследствие такого воздействия лазером не наблюдали .

       

В  исследованиях, по существу, впервые сделана попытка комплексного анализа возможностей лазерных технологий для проведения неинвазивным способом всех этапов пересадки ядер у млекопитающих. Результаты свидетельствуют об огромных возможностях оптико-лазерных приемов и перспективности их применения в клеточной инженерии в широком спектре исследований с ооцитами и ранними эмбрионами млекопитающих, и особенно в технологиях терапевтического и репродуктивного клонирования.

         В связи с разработкой оптико-лазерных приемов клонирования, методы клонирования с использованием механической микрохирургии  в будущем постепенно отойдут на второй план. Однако из-за более низкой стоимости оборудования и уровня требований к квалификации персонала при реализации процедур клонирования, методы механической микрохирургии в клонировании  возможно ещё долгое время будут использоваться для увеличения поголовья ценных пород сельскохозяйственных животных, а также в учебном процессе при изучении технологий вспомогательных репродуктивных технологий и для практической подготовки квалифицированных биологов и эмбриологов.

 

Заключение (выводы и комментарии)

Наиболее перспективным направлением в использовании технологии клонирования является клонирование  сельскохозяйственных животных с целью удовлетворения потребности населения в мясомолочных продуктах питания, и терапевтическое клонирование с целью получения белков, клеток и органов человека и животных для последующей их трансплантации и репликация клеток для научных исследований.

Подводя итог, отметим, что с помощью клонирования  посредством ядерного переноса у животных можно получить большое число особей с нужными комбинациями генов. Без клонирования имеющиеся уникальные сочетания генов легко утрачиваются из-за рекомбинации. Поэтому наиболее важной сферой применения репродуктивного клонирования должно стать сельское хозяйство. Другой важной областью применения репродуктивного клонирования может стать реконструкция вымерших видов животных и сохранение биоразнообразия в связи с проблемой исчезающих видов.

Репродуктивное клонирование человека пока остается  непригодным для увеличения численности населения из-за недостаточной отработки технологии клонирования на животных, на что указывают выявленные отклонения от нормы у клонированных организмов. Реализация идеи клонирования человека может порождать ряд межличностных проблем, связанных с тем, что донор генетического материала – не родитель, а близнец клонированного ребенка, что его генетические родители – это родители донора, а второй супруг генетически – это вообще  не родственник ребенка.

В то же время терапевтическое клонирование предоставляет возможность получения человеческих белков и органов, необходимых для борьбы с заболеваниями и укрепления здоровья человека путем пополнения запасов стволовых клеток.

Репродуктивное клонирование рассматривается пока только для животных как возможность зафиксировать уникальные особенности животных, которые имеют хозяйственное или любое другое значение или могут быть утрачены при обычном способе воспроизведения животных из-за рекомбинации генов во время мейоза.

Сегодняшняя ситуация с клонированием человека очень напоминает ситуацию 1940 г., когда был публично осужден метод искусственного оплодотворения . В государстве не должно быть законодательных вмешательств в репродуктивное поведение человека, поскольку он должен быть полностью свободен в личной жизни, в том числе и в своём отношении к вопросу воспроизводства. Родители имеют право выбирать альтернативные способы репродукции, чтобы избежать рождения детей с генетическими повреждениями. Клонирование может стать инструментом предупреждения генетических болезней, а также бесплодия.

Важно критически оценить  работу, в которой дается описание  экспериментов по созданию овечки Долли в 1995 – 1996 гг., когда в результате 277 попыток создания Долли не было получено ни одного уродливого, мертвого или дефектного плода или ягненка и ни одна беременность не закончилась выкидышем. Просто в 248 ооцитах из 277 не развились эмбрионы. Остальные 29 эмбрионов были подсажены в матки 13 овцам по 2 – 3 эмбриона. И только у одной из овец развилась беременность, которая завершилась рождением овечки Долли. Эти результаты совсем не такие ужасающие, как иногда представляют при оправдании запрета на клонирование человека.

      Федеральный закон от 20 мая 2002 г. N 54-ФЗ "О временном запрете на клонирование человека" вводит запрет на клонирование человека - создание человека, генетически идентичного другому живому или умершему человеку, путем переноса в лишенную ядра женскую половую клетку ядра соматической клетки человека.  Другие способы клонирования человека, например, эмбриональные клоны, рассмотренные выше в разделе 1.3.,  указанный закон не запрещает.

Сделан комплексный анализ возможностей лазерных технологий для проведения всех этапов пересадки ядер у млекопитающих. Результаты свидетельствуют об огромных возможностях оптико-лазерных приемов и перспективности их применения в исследованиях с ооцитами и эмбрионами млекопитающих, и особенно в технологиях терапевтического и репродуктивного клонирования. При этом методы механической микрохирургии будут использоваться как вспомогательные средства в перспективных технологиях клонирования организмов.

Эмбриональные клоны найдут практическое применение в трансплантации эмбрионов, так как клонирование позволяет, как минимум, удвоить количество потомков от ценных доноров.   

         При изучении природы старения организма представляют интерес исследования разновозрастных идентичных близнецов, датированное получение которых легко достижимо методом клонирования эмбрионов при глубоком замораживании частей эмбрионов с последующей их трансплантацией реципиенту в заданное время.

При естественном размножении, в отличие от клонирования, клетка проходит стадию мейоза. Возможно, именно во время мейоза происходит омоложение организма, когда генетический материал клеток  - их дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) очищается от накопленных за время жизни родительского организма повреждений и независимо от возраста родителей старение не передается от родителей к детям. Возможно, не случайно природа предусмотрела стадию мейоза именно накануне рождения нового организма.

В отличие от традиционного размножения, организмы, получаемые методом репродуктивного клонирования, не проходят стадию мейоза, который возможно избавляет потомство от повреждений генома в клетках их состарившихся предков.

Как долго будет жить клонированный человек никому не известно. Это может показать только опыт клонирования людей. Однако правомерность таких экспериментов вызывает сомнения.