ПЦР полимеразная цепная реакция

PCR (ПЦР) – полимеразная цепная реакция, основными функциями которой являются:
1. Увеличение числа копий ДНК
2. Введение мутации
3. Сращивание фрагментов ДНК
4. Диагностика наследственных заболеваний
5. Установление отцовства
6. Клонирование и выделение новых генов.

В упрощенном виде процедура ПЦР выглядит следующим образом: к образцу, содержащему ДНК добавляют нуклеотиды (строительные блоки) и полимеразу (фермент) и нагревают (плавят), чтобы между цепями молекулы ДНК разрушились водородные связи. Затем понижают температуру (отжтиг), чтобы праймеры связались с цепью ДНК. Повторяют цикл. Температура и время отжига сильно сказываются на результате. Неверный выбор этих параметров может привести к появлению не тех продуктов.
В случае РНК используют RT-PCR.

Поскольку РНК это одна цепь, чтобы провести ПЦР с нее в начале делают обратную транскрипцию, т.е. искусственно создают такую ДНК, которая может экспрессировать эту РНК последовательность.

Для осуществления этого процесса необходимо создать праймеры – минимальные генетические последовательности 18 -24 нуклеотидов.
Для сравнения геном SARS-CoV-2 составляет 30000 нуклеотидов.
Чтобы создать такие праймеры необходимо знать точную последовательность РНК, копии которой требуется увеличить. Работа с праймерами основана на принципе комплементарности, т.е. азотистые основания образуют водородные связи между собой только в виде следующих пар: А-Т и G-C для ДНК или А-U и G-C для РНК (А – аденин, Т- тимин, U- урацил, G-гуанин, C-цитозин). Таким образом, выбрав определенный участок ДНК или РНК, к этому участку создается точно комплементарная цепь – праймер. Далее следует предположение, что исследователю удастся подобрать такие экспериментальные условия, при которых этот праймер будет образовывать супрамолекулярную структуру именно с заданным участком. На деле это не такая уж и простая задача.

Кроме того, ПЦР должен иметь стандарт. Полученные копии в обязательном порядке должны сравниваться с эталонным образцом.
Все описанное выше имеет прямое отношение к основным функциям ПЦР, среди которых нет функции диагностики инфекционных заболеваний!


Некоторые тест-системы и их характеристики:

Вектор ПЦР 2019-nCoV-RG
OneStep ПЦР COV-RG
АмплиТест SARS-CoV-2

Порог обнаружения: от 5 – 10 копий
Скорость выполнения: 18 – 20 мин

Процедура выполнения:

1. Взять мазок
2. Нанести на картридж
3. Вставить в анализатор
4. Запустить с помощью соответствующего ПО
5. Получить результат.

Полностью автоматизированная процедура сводит работу эксперта к выступлению дрессированной обезьяны. Специалист, проводящий исследование таким образом, ничего по сути не может сказать об этом исследовании, не может отловить потенциальные ошибки или неисправности.

Центры по контролю и профилактике заболеваний CDC

07/13/2020
На 39 стр. мануала по работе с диагностической панелью:

«Поскольку количественные изоляты вируса 2019-nCoV в настоящее время недоступны, методы, предназначенные для обнаружения РНК 2019-nCoV, были протестированы с использованием охарактеризованных запасов полноразмерной РНК, транскрибированной in vitro (ген N; номер доступа в GenBank: MN908947.2)».

https://www.fda.gov/media/134922/download

Это послужило поводом сомневаться в существовании самого вируса.
Доктор Тушан де Сильва опровергает эти заявления по версии Reuters Fact Check от 21 октября 2020.


Де Силва сказал, что в документе описывается выявление порога определения теста ОТ-ПЦР.
«Чтобы рассчитать предел обнаружения анализа RT-PCR, вам необходимо иметь известное количество извлеченного вируса, или, альтернативно, известное количество РНК, идентичное тому, которое несет вирус», - слова де Сильва.
Также он заявил, что в настоящее время в лабораториях по всему миру хранятся сотни запасов культивированного SARS-CoV-2.


В январе 2020 вышла статья Corman-Drosten с описанием метода диагностики новой коронавирусной инфекции на основе теста ОТ-ПЦР.


Авторы заявляют: «Мы стремились разработать и внедрить надежную диагностическую методологию для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения без наличия вирусного материала».


27 ноября опубликован разбор протокола испытаний, описанного в статье Corman-Drosten.

 https://cormandrostenreview.com/report/....

В этом обзоре Borger с коллегами перечислили недостатки метода Corman-Drosten, приводящие к ошибкам диагностики:

1. Генетическая последовательно нового коронавируса SARS-CoV-2 установлена in silico, т.е. с применением симуляции, компьютерного моделирования. Эта последовательность была предоставлена китайской лабораторией, поскольку в то время «живой» или инактивированный SARS-CoV-2 не был выделен. Модель была основана на предположении, что новый вирус очень похож на SARS-CoV 2003 года, поскольку оба являются бета-коронавирусами. На сегодняшний день авторы так и не провели валидацию метода на основе изолированных вирусов SARS-CoV-2 или их полноразмерной РНК.

2. Бимолекулярный дизайн праймеров и зондов.

2.1 Оптимальный диапазон концентрация праймеров и зондов составляет 100-200 нМ. Тогда как в работе Corman-Drosten были использованы концентрации 600 и 800 нМ и не было описано причин, по которым потребовались такие высокие уровни. Увеличение концентрации праймеров ведет к увеличению неспецифического связывания.

2.2 Праймеры должены быть специфичным для целевого гена, который необходимо амплифицировать. Для получения воспроизводимых и сопоставимых результатов важно четко определить пары праймеров. В статье Кормана-Дростена мы наблюдали шесть неуказанных положений для трех последовательностей. Протокол ВОЗ из статьи Кормана-Дростена, заключает, что для подтверждения присутствия SARS-CoV-2 необходимо идентифицировать два контрольных гена (E- и RdRp-гены). Следует отметить, что ген RdPd имеет одно неопределенное («шаткое») положение в прямом праймере (R = G / A), два неопределенных положения в обратном праймере (R = G / A; S = G / C) и три – в зонде RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Таким образом, для гена RdPd можно синтезировать два разных прямых праймера, четыре обратных и восемь зондов. Всего существует 64 возможных комбинации праймеров и зондов!

2.3 Праймеры должны иметь оптимальный процент содержания GC относительно общего количества азотистых оснований (минимум 40%, максимум 60%), поскольку их комплементарноть включает три водородные связи, т.е. при малом содержании праймер будет слабо связываться с мишенью, а при большем, напротив, образует супрамолекулярные структуры не с целевымими олигонуклеотидами. Три праймера, описанные в статье Кормана-Дростена, не находятся в пределах нормального диапазона для содержания GC. Два праймера имеют 28% -31% и один 34,6% GC-значения. (Комментарий от себя: возможно повышенная концентрация потребовалась из-за того, что занижено GC-значение).

2.4 Для вирусной диагностики необходимо, чтобы не менее 3 пар праймеров обнаруживали 3 вирусных гена, желательно как можно дальше отстоящих друг от друга в вирусном геноме. В работе изначально рассматривали 3 гена, но один из них в итоге решили исключить из-за недостаточной чувствительности.


3. Количество циклов амплификации.
Для обнаружения вирусов предпочтительное количество циклов составляет 25-30. В случае, если вирус обнаружен поле 35 циклов и более, пациент не может считаться инфицированным. В этом случае вероятность того, что этот человек действительно инфицирован, составляет менее 3%, а вероятность того, что указанный результат является ложноположительным - 97%.

4. Положительный и отрицательный контроль
Тест ПЦР не содержит уникального положительного контроля для оценки его специфичности для SARS-CoV-2 и отрицательного контроля, чтобы исключить присутствие других коронавирусов, что делает тест непригодным в качестве специального диагностического инструмента для выявления вируса SARS-CoV-2.

5. Неправильно выбрана температура отжига.

6. Здесь перечислены не все слабые места метода Corman-Drosten, выявленные в работе Borger, подробнее см. здесь: https://cormandrostenreview.com/report/...


Серологические тесты на антитела

Для тех, кто думает, что тест на антитела более надежен, привожу следующую информацию.

В мире существуют миллионы вирусов вирусов, тогда как антител в крови 5 изотипов: IgA, IgG, IgD, IgE и IgM. Тестируют чаще на IgG и IgM.

Процедура тестирования:

1. Сыворотка крови
2. Добавляют вирус (!)
3. Проверяют, активировались (распознали) антитела вирус или нет.


Если пандемия не фейк

Под конец предлагаю, как в школе, решить задачку от противного (или от обратного):

1) Пусть SARS-CoV-2 опасный вирус и в мире пандемия, тогда надо отмотать год назад и представить, что произошло в Китае.
Ухань, декабрь 2019, оптовый рынок морепродуктов.
Начинаются массовые заболевания с повышенным летальным исходом, должно быть. В идеале еще нужна невиданная прежде симптоматика, чтобы местные медики забили тревогу, а ВОЗ заинтересовалась проблемой. Но нет, основные характерные симптомы: отсутствие обоняния, сухой кашель, повышенная температура…. И пневмония, как осложнение.

Хорошо, допустим, правда было страшно. Допустим, действительно, опасная болезнь.
2) Что должны сделать врачи и ученые? Найти причину этого страшного заболевания.
Поскольку основное осложнение пневмония, вспоминаем, чем она может быть вызвана.
Пневмонии:

1. Бактериальная (пневмококковая)
2. Грибковая
3. Вирусная
4. Вызванные атипичными возбудителями (хламидии, микоплазмиды)
И т.д. [1]

Аутоиммунные патологии и химические отравления опускаем.

3)В таком случае должны быть публикации на тему выявления этиологии заболевания COVID-19, какие-то эксперименты доказывающие, что проблема имеет именно вирусное происхождение, а не бактериальное, например. Таких публикаций нет.

4)Хорошо. Пусть будет вирус. Какой? Публикаций по выявлению, к какому семейству относится вирус (если относится) – нет.

5)Хорошо. Коронавирус. Какой? Для животных их известно более 40 серотипов, для человека – 6, не считая нового.

6)ВОЗ объявила – новый, а в марте месяце 2020 заявила о пандемии.

Далее все публикации о «новом» заболевании (в 2020 г. просто случился взрыв на эту тему) отталкивались от ряда представленных предположений:

Загадочная вспышка атипичной пневмонии в конце 2019 года была обнаружена на оптовом рынке морепродуктов в Ухане, Китай. В течение нескольких недель Всемирная организация здравоохранения объявила о новом коронавирусе, предварительно названном новым коронавирусом 2019 года (2019-nCoV) [2].

Секвенирование метагеномной РНК образца жидкости бронхоальвеолярного лаважа, полученного от пациента, выявило новый штамм РНК-вируса из семейства Коронавирусов, который обозначен здесь WH-Human 1 (и также упоминается как 2019-nCoV). Филогенетический анализ полного вирусного генома (29903 нуклеотида) показал, что вирус был наиболее тесно связан (89,1% нуклеотидного сходства) с группой SARS-подобных коронавирусов (род Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus), которые ранее были обнаружены у летучих мышей в Китае [3].


Ссылки:

1. А. А. Бова. ПНЕВМОНИИ: ЭТИОЛОГИЯ, ПАТОГЕНЕЗ,КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА. Военно-медицинский факультет в УО «Белорусский государственный медицинский университет».
2. Jasper Fuk-Woo Chan, Kin-Hang Kok, Zheng Zhu, Hin Chu, Kelvin Kai-Wang To, Shuofeng Yuan, Kwok-Yung Yuen. Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan. Emerg Microbes Infect. 2020 Jan 28;9(1):221-236. doi: 10.1080/22221751.2020.1719902. eCollection 2020. [PMID: 31987001]
3.  Fan Wu, Su Zhao, Bin Yu, Yan-Mei Chen, Wen Wang, Zhi-Gang Song, Yi Hu, Zhao-Wu Tao, Jun-Hua Tian, Yuan-Yuan Pei, Ming-Li Yuan, Yu-Ling Zhang, Fa-Hui Dai, Yi Liu, Qi-Min Wang, Jiao-Jiao Zheng, Lin Xu, Edward C Holmes, Yong-Zhen Zhang. Author Correction: A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020 Apr;580(7803):E7. doi: 10.1038/s41586-020-2202-3. [PMID: 32296181]
4. https://www.fda.gov/media/134922/download...
5. 6. 7. https://cormandrostenreview.com/report/...