Глава 7. Изучение поведения бактериофага

К моменту публикации своей первой статьи Д’Эрелль провел уже более пятидесяти пересевов бактериофага на дизентерийных культурах. Такой пересев (его называют еще пассаж) Д’Эрелль проводил следующим образом: к бактериальной взвеси в бульоне прибавлял следы сильнодействующего соответствующего бактериофага. По истечению нескольких часов при 37 С наступало полное растворение бактерий и среда становилась  прозрачной, как до посева. Прибавление такого просветленного фаголизата к новой взвеси бактерий в бульоне снова вызывало растворение бактерий и просветление бульона. “И сколько бы раз не повторять этот опыт, - пишет Д’Эрелль, - он всегда приводит к одним и тем же результатам. Ежедневно в течение трех лет, а иногда даже 2-3 раза в день, я проводил такого рода пассажи с одним и тем же штаммом, прибавляя к новой взвеси по 0,001 мл предыдущей растворившейся культуры. После более чем 1500 пассажей последняя просветленная культура была не только столь же вирулентной как первая, но даже гораздо вирулентнее ее”.

Уже в своей первой публикации (1917 г.) Д’Эрелль особо подчеркнул, что “в отсутствии дизентерийных бацилл микроб-антагонист не растет ни на какой среде”. Позднее он писал: “Я безуспешно пытался добиться размножения бактериофага в мертвых бактериях, причем причина смерти была совершенно безразлична – старость, нагревание, обработка хлороформом, спиртом, сулемой, йодом или другими средствами. Отсюда следует, что бактериофаг является безусловным паразитом, способным существовать лишь за счет живых бактерий”. Неполное просветление старых культур вызвано тем, что количество жизнеспособных клеток в них незначительно. Руководствоваться просветлением культуры, как единственным критерием действия бактериофага, может привести к неверным выводам.

Д’Эрелль отмечал, что уже в суточной бульонной культуре Шига-палочек (при 37 С) жизнеспособными остаются не более 1/3 всех микробов, а на косом агаре при прочих равных условиях, все микробы живы. При добавлении бактериофага к суточной бульонной культуре полного растворения не наблюдается, а смыв с агара просветляется до полной прозрачности.

Д’Эрелль рассуждал так: “Если развитие бактериофага происходит внутри бактерии, то во время процесса размножения засеянные бактериофаги должны исчезать из жидкой культуры”. И это он подтвердил опытным путем. Опыт состоял в следующем.
 
К жидкой питательной среде добавлялась дизентерийная культура (палочка Шига). Это был опытный вариант. Помимо него ставилось два контроля. Контроль I – только питательная среда, и контроль II та же питательная среда, но с холерным вибрионом. Ко всем трем вариантам был добавлен очень активный дизентерийный шигафаг.
 
Сразу после добавления бактериофага, а также через 30, 60, 90 мин после выдержки при 37 С брали выемки для определения количества фаговых частиц в центрифугатах (центрифугировали 10 мин при 4000 оборотов в минуту).

Сразу после добавления бактериофага он легко обнаруживался во всех вариантах по образованию стерильных пятен на агаре. Но уже через 30 мин в центрифугате пробы из опытного варианта бактериофаг не обнаруживался. Такой же результат получен и через 60 мин. В контрольных образцах количество фагов в центрифугатах осталось без изменения. Холерные вибрионы не чувствительны к дизентерийному бактериофагу, и они даже не адсорбируют его, не инактивируется он и в питательной среде. Через 90 мин как в нецентрифугированной взвеси, так и в центрифугате проб из опытного варианта был обнаружен бактериофаг, превышающий его исходное количество в восемнадцать раз. Одна микробная клетка произвела восемнадцать бактериофагов.
 
Через 90 мин наблюдалось почти мгновенное разрушение бактерий. Последующее размножение бактериофага происходило толчками. Промежуток между двумя периодами размножения бактериофага, как пишет Д’Эрелль, колеблется между 1 ; и 1 ; часами. В параллельных опытах, когда центрифугованию подвергали пробы через 10 мин, отмечено, что первые 10 мин бактериофаг практически не исчезал из культуральной жидкости, а через 20 мин его там почти не оставалось. Таким образом, заключает Д’Эрелль, время, необходимое для проникновения бактериофага внутрь бактерий равно около ; часа, т.е. 15 мин. Д’Эрелль пишет, что “это наиболее простой случай, а именно бактериофаг максимальной вирулентности действует на чувствительную бактерию, безусловно, губительно”. “Однако, исход этой борьбы между бактериофагом и бактериями не всегда одинаков”. Активность бактериофага не является величиной постоянной “и бактерии относятся к процессу растворения не безразлично, и оказывают ему противодействие” и даже “могут развиваться в присутствии бактериофага”.
 
В опытах со слабовирулентным бактериофагом наблюдалась следующая закономерность: он исчезал из культуральной жидкости в промежутке от 1 часа до 2-3 дней, как пишет Д’Эрелль “с тем, чтобы потом больше не появляться… Его ультрамикроскопические зародыши точно также проникают в тело бактерий, но там не размножаются”. Бактерии становятся резистентными к данному бактериофагу.

Д’Эрелль рассматривает взаимодействие микробной клетки и бактериофага как противостояние. Вирулентный бактериофаг, проникая в клетку, размножается в ней, а в случае слабовирулентного бактериофага микробная клетка может оказать сопротивление. Д’Эрелль заключает: “Экспериментально установленные факты внедрения вирулентных бактериофагов в бактерии подтверждают предположение, что частицы маловирулентные могут сохраняться в латентном состоянии внутри бактерий. Как только резистентность микроба ослабевает, наступает развитие вируса”.

Д’Эрелль наблюдал развитие у бактерий резистентности и к вирулентным фагам. “В некоторых случаях, - пишет он, - можно наблюдать, что спустя несколько дней после наступившего растворения бактерий и полного просветления среды, в ней снова появляется муть”. Это тот самый вторичный рост, который ведет к образованию вторичных культур. Такие бактерии, оказавшие сопротивление бактериофагу, Д’Эрелль называл также резистентными (поскольку они становятся невосприимчивыми к фагу, от которого произошли), мутантами, а позднее “хроническими носителями бактериофага”.
 
Д’Эрелль ввел также понятие смешанных культур, когда в культуральной жидкости помимо вторичной культуры, находится бактериофаг, обусловивший ее фаго-резистентность.
 
“Необходимо при определении чистоты культуры бактерий, - пишет Д’Эрелль, - выявлять не только отсутствие в ней других видов бактерий, но так же отсутствия бактериофага”. Бактерии, лишенные бактериофага, он называл “ультрачистыми”. По мнению Д’Эрелля, “многие из бактериальных культур в наших коллекциях являются на самом деле культурами смешанными… полученные прямо из организма больного кишечные палочки представляют собой смешанные культуры, из них удалось получить деятельный бактериофаг”.
 
Д’Эрелль показал, что различные штаммы одного и того же вида бактерий не всегда обладают одинаковой степенью сопротивления против одного и того же бактериофага. Одни штаммы, как правило, образуют вторичные культуры, другие бактерии того же вида образуют их лишь в виде исключения, третьи, наконец, их никогда не образуют. В качестве примера он описывает опыт с двумя штаммами палочки Шига, один штамм музейный из института Пастера, другой свежевыделенный от больного. Бактериофаг был взят один и тот же, полученный на основе музейного штамма. Опыт был поставлен 6 раз для каждого штамма по 12 пробирок в опыте. После полного просветления на четвертый день выдержки при 37 С наблюдался вторичный рост. Для музейного штамма количество пробирок с вторичным ростом составило 12%, для свежевыделенного 70%. Опыт был продолжен с использованием бактериофага к свежевыделенному штамму. Выявлена интересная закономерность. Бактериофаг, выделенный от больного в момент выздоровления, не давал вторичных культур со своим штаммом (свежевыделенным), но образовывал их с музейным штаммом.  Д’Эрелль отмечал, что в присутствии высоковирулентного бактериофага вторичные культуры возникают сравнительно редко, но раз образовавшись, они имеют очень характерный вид.

Исход противостояния бактерия-бактериофаг, который приводит либо к размножению бактериофага в микробной клетке и ее лизису, либо бактерия, оказав сопротивление бактериофагу, становится резистентной к нему, зависит не только от свойств бактерии и бактериофага, но и от их количественных соотношений, а также от условий, в которых находятся.

При высеве таких бактерий на агар вырастает вполне нормальная культура без стерильных пятен. Д’Эрелль пишет далее, что если эту культуру пересевать на чашках, то “иногда через несколько пересевов (2-4, а иногда и после 30 пересевов для наиболее упорных случаев) появляются совершенно ясные стерильные пятна, обусловленные развитием колоний бактериофага… Внезапное появление бактериофага можно объяснить таким образом: В какой-нибудь одной бактерии бактериофаг остался невредим. С течением времени он преодолел ее сопротивление и размножился, при этом вирулентность его повысилась. Другого объяснения нет”.
 
Д’Эрелль уделил особое внимание изучению бактерий, ставших устойчивыми к бактериофагу. У резистентных бактерий повышается жизнеспособность, изменяются морфологические и культуральные свойства, изменяется вирулентность. “Невзирая на различие признаков, - пишет Д’Эрелль, - резистентные штаммы принадлежат к тому же виду, от которого произошли и они вновь легко превращаются в исходную форму со всеми ее типичными свойствами”. Чтобы резистентную форму бактерий вернуть в обычную, “просто достаточно удалить бактериофаг, который может  рассматриваться как причина возникновения описанных мутаций”.

“Резистентность сохраняется до тех пор, - пишет далее  Д’Эрелль, - пока бактерии находятся под влиянием бактериофагов”.

В то же время, как отмечал Д’Эрелль, бактерии всегда можно сделать резистентными по отношению к бактериофагу, и это явление может быть вызвано по произволу. Созданию таких искусственных мутантов и изучению их свойств Д’Эрелль посвятил 5 лет (1929-1933 гг.) работы в Йельском университете (США) и он рассматривал эту работу как “экспериментальное подражание процессу естественному” (см. гл.16).

Уже в 1920 г. Д’Эрелль опубликовал статью о приобретении бактериями резистентности к бактериофагу, сопровождающуюся изменением их свойств. Тем не менее, рождение генетики бактерий датируют 1943 г. с публикации статьи Лурье и Дельбрюка “Мутации, в результате которых бактерии, чувствительные к вирусу, приобретают к нему устойчивость”.

Точно также, описанные Д’Эреллем два возможных варианта поведения бактериофага в микробной клетке (литический цикл или переход в латентное состояние) были восприняты в научном мире лишь после исследований группы Львова в институте Пастера в Париже (1950 г.) через год после кончины Д’Эрелля. Поражает удивительная прозорливость Д’Эрелля и умение найти верный путь в совершенно неизведанном мире.