Глава 11. Геморрагическая лихорадка буйволов

В конце 1919 г. в Париже сделал небольшую остановку Йерсин - директор института Пастера в Индокитае. В разговоре Йерсин выразил сожаление, что небольшое количество бактериологов в Индокитае не позволяет проводить исследования, которые крайне необходимы. Например, исследования барбоны, болезни, которая уничтожает буйволов, единственных животных для работы на рисовых плантациях. Д’Эрелль выразил желание поработать в этом направлении. Йерсин принял это предложение и в январе 1920 г.  Д’Эрелль уехал в Индокитай в качестве референта правительства страны. “Индокитай – страна моих мечтаний: там встречается холера, чума, разнообразные падежи скота. Как эта ужасная барбона, которая несколько лет назад уничтожила всех буйволов острова Ява, более миллиона в течение нескольких месяцев” – так говорил об Индокитае Д’Эрелль. Именно такие смертельно опасные быстропротекающие инфекционные заболевания привлекали его внимание, поскольку изучение их позволило бы лучше выявить роль бактериофага в выздоровлении.

Следует отметить, что в свое время Йерсин, которого Д’Эрелль назвал наиболее интересной достопримечательностью Индокитая, тоже был зачарован этой страной. Студент-медик, швейцарец по происхождению, в институте Пастера в Париже он был сотрудником Роукса в исследованиях токсина дифтерии. В 1888 году после опубликования своих работ он получил сумму в 20 или 30 тысяч франков, и, чтобы удовлетворить свое желание к приключениям, он предпринял исследовательскую экспедицию по реке Хаут-Меконг. Это путешествие чуть не стоило ему жизни, но Индокитай стал его второй родиной и вьетнамцы высоко чтут память об этом человеке. В институте Пастера в Ньячанге есть музей Йерсина.

“То, что желало правительство, - пишет Д’Эрелль, – это предупредительные меры по борьбе с барбоной”. В стране, где мало ветеринаров и они не могут быстро оказаться в нужном месте, вакцинация является наиболее оправданным подходом решения этой проблемы.

Барбона или геморрагическая лихорадка буйволов, возбудителем которой является Pasteurellae bovis, принадлежит к числу самых опасных болезней. Смертность от нее иногда доходит до 99%. Инкубационный период от 18 до 24 часов, редко 36 часов. При барбоне не наблюдается никаких явлений со стороны кишечника, она протекает как типичная геморрагическая септицемия.

Известно, что к болезням желудочно-кишечного тракта (дизентерия, холера) иммунитет не вырабатывается. Иммунитет возникает после болезней септических: чума, брюшной тиф. Следовательно, барбона тоже должна была быть иммунизирующейся болезнью.
 
Работа проводилась в сотрудничестве с Ле Луэ, директором ветеринарной службы Кохинхина.

Ожидая выгодный момент, чтобы изучать естественную болезнь во время эпидемии, Д’Эрелль начал испытания по вакцинации животных ослабленной культурой барбоны, метод аналогичный тому, какой применял Пастер для предупреждения чумы домашней птицы. При отъезде из Парижа,  Д’Эрелль взял культуру пастереллы барбоны из коллекции института Пастера, выделенную 20 лет назад в Италии, периодически пассированную на кроликах, животных крайне нечувствительных ко всем Pasteurella. Рассчитывая, что пассажи на кроликах смягчат ядовитость, он сделал 6 пассажей обычным методом. После смерти шестого кролика, он взял кровь из сердца и одну каплю этой крови поместил в стерильный бульон. После суточной инкубации была получена вакцина для прививки.  Д’Эрелль ввел 1 мл этой вакцины бычку. Образовалась небольшая опухоль, но без общих расстройств. Через две недели впрыснул смертельную дозу пастереллы, бычок остался жив. Но чтобы этот метод осуществить на практике, по мнению Д’Эрелля, надо испытать культуру хотя бы двухнедельной выдержки, чтобы узнать не изменятся ли ее свойства во время ее транспортировки в отдаленные регионы. Результат был парадоксальным. Два бычка, привитые той же дозой (1 мл) той же вакциной (но после двухнедельной выдержки), заболели типичной барбоной и умерли через 36 часов. Надо было найти причину этой аномалии.

Д’Эрелль предположил, что определяющую роль играет питательная среда, на которой выращивалась и сохранялась культура. Он начал новый опыт. Ввел культуру пастереллы кролику и кровь из сердца этого мертвого кролика засеял в два флакона: в одном была питательная среда из говяжьего мяса, в другом – из мяса кролика. После восемнадцати часов инкубации, когда культура хорошо выросла, сделал прививку двум бычкам из каждого флакона. Бычки остались здоровы как после прививки, так и после заражения их смертельной дозой культуры через 20 дней после иммунизации.

Сразу после взятия выемок из флаконов для иммунизации флаконы с патогенными культурами были стерильно запаяны и хранились в темном месте. Спустя двадцать дней были снова сделаны прививки двум бычкам из каждого флакона с той же дозой. Те бычки, которым была введена культура на говяжьем бульоне, заболели типичной барбоной и умерли через 36 часов. Два бычка, получившие культуру с кроличьего бульона, хорошо перенесли прививку и остались живыми после введения смертельной дозы культуры через 20 дней после прививки, следовательно, они были иммунными. Повторный опыт дал идентичный результат.

Возможно, именно результаты этих опытов позволили Д’Эреллю заявить (глава 3 из его воспоминаний), что если бы ему снова пришлось готовить культуру коккобацилл для заражения саранчи, он бы выращивал ее на бульоне, приготовленном из самой саранчи. Аналогично вышеописанному опыту такая питательная среда повышала бы вирулентность коккобацилл по отношению к саранче, как говяжий бульон повысил вирулентность пастерелл к бычкам.

“С точки зрения практики, - пишет  Д’Эрелль, - была найдена культура ослабленной пастереллы, сделанной на бульоне из кролика. Но меня это не удовлетворяло, так как такая прививка не безопасна. В стаде из 100 быков, привитых смягченной культурой, всегда хоть один да умирал”.

“Чтобы начать исследования по другому пути, - пишет Д’Эрелль, - мне надо было найти резкие бактериофаги по отношению к пастерелле”.

В начале мая Ле Луэ был уведомлен о вспышке барбоны в одной деревне провинции Бак Лье. Первый буйвол умер 5 мая, до 13 мая погибло 17 буйволов. К моменту их приезда (10 мая) было 4 больных буйвола, которые все умерли после 13 мая. Д’Эрелль взял образцы испражнений у этих четырех буйволов, у 10 здоровых буйвола в этой же деревне, а также у 10 буйволов (выборочно, наугад) в соседних деревнях, где не было ни одного случая заболевания.

По возвращению в Сайгон Д’Эрелль проанализировал эти образцы. Результат, как он пишет, был абсолютной четкости. У 4 погибших буйволов был обнаружен только нормальный колифаг без какой-либо активности к барбоне, так же как и у буйволов из деревень, где совсем не было болезни. Но у 10 здоровых буйволов, находящихся в контакте с погибшими животными, в испражнениях был обнаружен бактериофаг, обладающий высокой активностью к пастереллам, который, вероятно, и защитил их от гибели.

Вскоре появилась возможность еще раз проверить эти первые результаты. В начале июня начался массовый падеж скота на полуострове Камао, южная оконечность Кохинхина. Правительство предоставило в распоряжение маленькую яхту. В течение почти 20 дней они плавали по рекам, окруженные нереальным пейзажем по обоим берегам. Это был девственный лес, с обильной, непроницаемой для солнечных лучей зеленой массой. Здесь в хаотическом порядке росли деревья, кусты, бамбук, лианы, все это переплелось и представляло собой непроходимые заросли с учетом влажной, подобно губке почвы, наполненной водой. Именно вдоль этих рек свирепствовал падеж скота. Как вспоминает  Д’Эрелль, что в своей жизни более мрачного пейзажа он не видел. Раздутые трупы буйволов, запах падали, тяжелый, насыщенный паром воздух. За несколько дней падеж скота распространился на площадь, равную 2 или 3 французским провинциям. Падеж скота продолжался около 30 дней, затем прекратился также внезапно, как начался.
 
За этот период погибло около пятнадцати тысяч буйволов из 30 тысяч, проживавших в этом регионе, и не было ни одного случая выздоровления. Анализ взятых образцов подтвердил сделанные ранее наблюдения. В кале больных буйволов никогда не было бактериофага, активного к возбудителю барбоны. Среди еще здоровых буйволов были такие, которые содержали бактериофаг, активный к барбоне и те, у которых такой бактериофаг отсутствовал. Выживали только первые, в кишечнике которых содержался бактериофаг, активный к пастереллам.

“Возникает вопрос, - рассуждает Д’Эрелль, – как получается, что бактериофаг, который обычно находится в кишечном содержимом, смог вмешаться в сепсис, когда патогенная бактерия находилась в крови и тканях. Я произвел исследования по этому поводу при разных болезнях: брюшном тифе, птичьем тифе, барбоне, и я констатировал, что бактериофаг не оставался в пределах кишечника. Его удавалось изолировать из циркулирующей крови и пораженных тканей. В связи с крайне малым размером частицы бактериофага свободно преодолевают слизистую оболочку кишечника, а оттуда кровью бактериофаг разносится в ткани”.

После окончания эпизоотии  Д’Эрелль исследовал испражнения 20 животных, которые выжили, вернее совсем не болели в очаге инфекции и в радиусе 15 км. У всех был обнаружен бактериофаг против барбоны. Спустя 5 месяцев Д’Эрелль проверил испражнения восьми буйволов и нашел у них бактериофаг активный против барбоны. В иле болота, где в жаркий день буйволы находятся по шею в воде, Д’Эрелль так же обнаружил бактериофаг против барбоны. В зараженных местностях Д’Эреллю удалось 2 раза выделить бактерии барбоны из ила болот местности, где пасутся буйволы. Свои наблюдения  Д’Эрелль заключает фразой “Больные животные разносят болезнь, резистентные животные распространяют иммунитет” (под иммунитетом он подразумевает бактериофаг).

Во время поездок по Индокитаю Д’Эрелль исследовал испражнения 41 буйвола в разных деревнях, где уже около двух лет не было заболеваний барбоны. Бактериофаги были у всех, но направлены против кишечных бактерий и только в трех случаях он обнаружил бактериофаг слабой активности против барбоны. Не было активного бактериофага к барбоне и у животных, находящихся на расстоянии более 15 км от очага инфекции, и у смертельно больных животных, и в трупах животных. Но такой бактериофаг, как упоминалось ранее, он обнаружил у четырех буйволов, оставшихся живыми в помещениях, где умерли буйволы, и у четырех буйволов из незараженного хлева в этой же местности. Следовательно, делает вывод Д’Эрелль, “у буйволов, оставшихся в живых, в кишечнике находится достаточно вирулентный бактериофаг”, который и обеспечил им невосприимчивость к болезни.

Приобретенный иммунитет  Д’Эрелль рассматривает как последствие выздоровления, спровоцированное патогенными бактериями, разрушенными бактериофагом. Для Д’Эрелля представилась возможность проверить уже давно сформулированную им гипотезу “а именно, создать у животных крепкий, длительный иммунитет, используя для иммунизации бактериофаг”.
 
Культура бактериофага в пробирке по словам Д’Эрелля, содержит четыре элемента: 1) частицы бактериофага; 2) лизины, выделенные бактериофагом при фаголизисе; 3) растворенные фрагменты бактерий; 4) продукты бактерий, выделенные ими до распада.
 
Такие фаголизаты следует рассматривать как полноценные антигены. Для их приготовления не требуется подвергать микробы ни химическому, ни термическому, ни механическому воздействию, которые ухудшают их свойства. Достаточно ввести под кожу буйвола культуру бактериофага, чтобы спровоцировать у них иммунитет.
 
В своей первой монографии Д’Эрелль посвятил целую главу (гл.3, часть II) иммунизации буйволов бактериофагами. По мнению Д’Эрелля, “барбона для таких исследований является превосходным объектом… Экспериментальное заболевание до мельчайших деталей повторяет картину заболевания естественного”.

Для проведения таких опытов нужно было большое количество животных. Правительство предоставило все необходимые кредиты. Однако, приобрести буйволов в Индокитае было очень трудно. Аннамиты настолько были привязаны к своим буйволам, которые для них были как верные слуги, что какую бы цену не предлагали, они от них не могли отказаться. И даже, когда в возрасте 20-25 лет животные уже не могут больше работать, хозяева продолжают их кормить, заботиться о них. Единственное животное, которое можно было приобрести, это были бычки (которые шли на бойню). Бычки более чувствительны к барбоне, чем буйволы. Их использовали для текущих опытов, а буйволов оставляли для завершающих.

Бактериофаг для иммунизации был выделен из испражнений буйвола, который при эпидемии, описанной ранее (в Камау), остался здоровым. Этот бактериофаг с самого начала обладал высокой вирулентностью, которая была усилена через 10 пассажей. Совершенно прозрачный фаголизат бактерий барбоны фильтровали через свечу Шамберлена (стерилизующая фильтрация), разливали в ампулы и запаивали. Бактериофаг сохранял свою активность в течение 5 месяцев работы. Использовали абсолютно здоровых животных в возрасте от 12 до 18 месяцев. Для проведения этих опытов пришлось построить специальные конюшни в институте. В конюшне помещалось 30 животных.
 
Для заражения животных был отобран штамм Pasteurellae bovis, выделенный из крови буйвола, умершего при падеже скота в Камау. Минимальная смертельная доза этого штамма составляла одну тысячную мл, т.е. один мл суточной бульонной культуры содержал тысячу смертельных доз. Поражает разница в вирулентности музейных штаммов пастереллы, ослабленных через организм кроликов (которые упоминались ранее) и свежевыделенных при вспышке барбоны.

Трудность возникла при подборе дозы бактериофага для иммунизации. Не было никаких прототипов. И этот первый шаг оказался неудачным. Восьми бычкам ввели подкожно однократно по 20 мл бактериофага. Через 2 недели двум опытным бычкам и одному контрольному ввели по 50 минимальных смертельных доз отобранного штамма пастереллы. Все животные умерли, причем опытные даже на несколько часов раньше контрольного (не получившего бактериофаг). Через 5 дней, т.е. спустя 20 дней после вакцинации, 2 опытных бычка и один контрольный были испытаны таким же образом. И опять все три погибли, и опять привитые – первыми.
 
“Одно из двух, - пишет  Д’Эрелль, - либо моя гипотеза была неверна, либо доза была не приспособлена к этой гипотезе. Факт активации, казалось, показывал, что доза была преувеличена”.
 
Далее он проверил иммунизирующую дозу бактериофага в 5,0 мл с заражением животных культурой через 13, 15 и 20 дней после прививки. И опять все бычки умерли, но одновременно с контрольным. Параллельно со вторым опытом были заражены культурой барбоны 2 бычка от первого опыта, т.е. через 40 дней после прививки. Все умерли. И опять сомнения: либо бактериофаг не обладает никаким иммунизирующим действием, либо взятые дозы слишком велики.

Д’Эрелль делает третью попытку. Трем буйволам и четырем бычкам он вводит по 0.25 мл бактериофага. Через 20 дней всем животным, оставшимся живыми от первого опыта (2 бычка, привитые 60 дней тому назад 20 мл бактериофага), от второго опыта (2 бычка, привитые 40 дней тому назад 5,0 мл бактериофага) и последним семи животным, получившим дозу бактериофага 0,25 мл 20 дней назад, было введено по пятьдесят минимальных смертельных доз пастереллы. Всего одиннадцати опытным животным и трем контрольным (2 бычка и один буйвол, не получавших бактериофаг).
 
Д’Эрелль поясняет, почему он брал в качестве разрешающей дозы не одну минимальную смертельную дозу культуры, а 50, а в последующих опытах и 1000 минимальных смертельных доз и даже 2000. По его мнению, иммунитет либо есть и он абсолютен, либо его нет, и иммунному животному одинаково, что две, что сто минимальных смертельных доз.

Заражение животных он провел в 11 часов дня. Ни днем, ни вечером  Д’Эрелль не собирался смотреть животных. Он ждал момент, когда с одного взгляда будет виден результат. И этот момент настал. Вот как Д’Эрелль его описывает: “Я проснулся в четыре часа, спешно оделся, взял фонарь и пошел в конюшню. Шел дождь, дул порывистый ветер, низко плыли крупные черные облака. Достаточно было одного взгляда: три контрольных животных покоились на земле. Шея растянута огромной опухолью. Они уже окоченели. Все привитые животные были совершенно здоровы. Я прощупал их шеи, ни малейшего следа воспаления. Моя гипотеза была проверена с такой полнотой, на которую я не смел надеяться. Мое волнение было настолько сильным, что я разрыдался,… Животные смотрели на меня своими большими круглыми глазами, освященные фонарем”. На следующее утро он ввел всем животным еще по тысяче смертельных доз. Все выдержали. Их иммунитет был абсолютен. Д’Эрелль вспоминает, что его волнение, без сомнения, было так сильно потому, что “он попал в цель”. Оставалось только выяснить, как влияет количество иммунизирующей дозы на инкубационный период. Были закуплены новые животные, чтобы продолжить опыты по выяснению этой зависимости.

В результате этих опытов были подобраны оптимальные схемы иммунизации буйволов бактериофагом. При дозе 20 мл бактериофага инкубационный период составил 50-60 дней. При дозе 5 мл – 40 дней, при дозе 0,25 мл – 13-20 дней, при дозе 0,05 мл – 4-5 дней. При такой схеме иммунизации животные выдерживали 50 и даже 1000 минимальных смертельных доз патогенной культуры.

Для выявления фаз, через которые проходит иммунизированное животное, буйволам подкожно вводили бактериофаг в дозе 0,5 и 0,25 мл, а разрешали 5 минимальными смертельными дозами пастереллы. Исследования показали, что в течение первого периода от 24 до 36 часов животное оказывает сопротивление заболеванию и этот короткий период Д’Эрелль назвал “гетерологическим иммунитетом”. В это время бактериофаг можно обнаружить в крови и в кишечнике (в испражнениях). Причем в кишечнике бактериофаг удерживается дольше (от 2 до 3 суток), чем в крови (до 24 часов, максимум – 48 часов). В этот период присутствие бактериофага обеспечивает животным невосприимчивость к заражению. Но затем бактериофаг все равно исчезает из организма раньше, чем выработается истинный приобретенный иммунитет. Заражение животных в этот период, вплоть до окончания инкубационного периода, приводит к неминуемой гибели. В конце инкубационного периода переход животного к невосприимчивости к заражению происходит скачкообразно. Животное приобретает, по словам Д’Эрелля, “абсолютный иммунитет”, который позволяет животному выдерживать тысячи смертельных доз патогенного микроба.

Исследование крови иммунных животных показало, что она в количестве 0,5 л создает пассивный иммунитет у не иммунизированных буйволов и защищает их от тысячекратных доз культуры барбоны при 100% гибели контроля.

Д’Эрелль поставил опыт по инактивации бактериофага глицерином. Д’Эрелль смешал глицерин и фаголизат (фаголизат, помимо частиц фага, содержит еще фрагменты разрушенных фагом микробных клеток) в равных объемах, выдержал смесь десять дней при температуре 37 С, убедившись, что бактериофаг полностью инактивировался, он ввел эту смесь, разбавив физраствором, из расчета, чтобы каждое животное получило по 0,25 мл исходного бактериофага. Когда через 45 дней животные были инфицированы смертельной дозой бактерий барбоны, они остались здоровы, несмотря на разрушение бактериофага. Прогрев глицеринового фаголизата 30 мин при 36 С значительно снизил иммунизирующее действие такой вакцины.

Эти опыты показали, что сам бактериофаг не оказывает влияния на выработку иммунитета, а прогрев фаголизата снижает его иммунизирующую активность, тоже, что наблюдается при изготовлении обычных бактериальных вакцин. Д’Эрелль пишет: “культуры бактерий, которые были убиты либо нагреванием, либо добавлением антисептиков, такие как антитифоидные, антихолерные, антистафилококковые, антипневмококковые и другие, лишены, в действительности, любой ценности”. В чем он убедился при исследовании холеры в Индии. По мнению Д’Эрелля, разрушение микробных клеток бактериофагом приводит к изменению их физико-химического состояния, образуются совершенно новые вещества, которые и обуславливают выработку иммунитета. Возможно, не последнюю роль играют литические ферменты, вырабатываемые бактериофагом.

Всего в этих опытах было использовано более 100 бычков и буйволов. “Благодаря благосклонности г-на Приве, администратора зеленых насаждений Ан-Лок и Сузаннах, - пишет  Д’Эрелль, - мы смогли провести последний опыт на стаде буйволов. Из двадцати животных, пятнадцать взрослых, двух старых (15-20 лет), но еще работающих, и трех очень старых (25-30 лет)”. Каждому ввели подкожно по 0,25 мл бактериофага. Через 40 дней все были испытаны введением тысячи минимальных смертельных доз сильно вирулентной пастереллой. Пятнадцать взрослых буйволов не испытывали никаких признаков болезни, у двух старых буйволов появилась местная опухоль, но быстро исчезла. Животные остались живы. Очень старые буйволы заболели и через 3-6 дней умерли.

После отъезда Д’Эрелля из Индокитая, сотрудничавший с ним Ле Луэ, директор ветеринарной службы Кохинхина, продолжил исследования. Он убедился в том, что животные, иммунизированные 0,25 мл использованного еще Д’Эреллем фаголизата, остались живыми после введения им двух тысяч минимальных смертельных доз патогенной культуры пастерелл.

В январе 1921 г. он вакцинировал 15 годовалых бычков 1 мл. месячным фаголизатом пастерелл для проверки длительности сохранения иммунитета. Заражение животных было проведено в марте 1922 г. Спустя 14 месяцев они еще сохраняли иммунитет.
В это же время Ле Луэ провел масштабную иммунизацию бактериофагом более 100 000 буйволов. В течение восемнадцати месяцев после иммунизации ни один буйвол не умер. Вскоре Ле Луэ был переведен в Ханой в главное управление ветеринарной службы. На этом иммунизация буйволов в Индокитае была прервана. Работу с бактериофагами поручили аннамитскому лаборанту, который потерял бактериофаг, выделенный Д’Эреллем, хотя в институте Пастера Сайгона был опытный бактериолог, который был способен выделить бактериофаги. Недружелюбие руководителей института Пастера проявилось и при работе Д’Эрелля с чумой. Об этом будет написано в гл.12. 

В последние годы бактериофаги все больше привлекают к себе внимание как антигены для активной иммунизации. И хотя механизм, лежащий в основе иммуногенности фаговых лизатов не ясен, но их достоинство ни у кого не вызывает сомнения. Вызванный фагами лизис бактерий более эффективный и мягкий метод воздействия на бактерию, чем прочие, используемые ранее методы (физические, механические, химические). Однако такие исследования проводятся пока только в животноводстве [12].