Бактериофаг как мельчайшая форма жизни

Д’Эрелль писал: “Нам кажется, что если изучение электрона, наименьшего возможного количества вещества, приблизило физиков к уяснению сущности материи, то углубленное изучение бактериофага, элементарного существа, поможет бактериологам понять механизм жизни” [1].

Когда в 1910 г., будучи еще в Мексике, Д’Эрелль впервые увидел стерильные пятна на агаровой культуре коккобацилл, у него сразу мелькнула мысль, что этот паразит (кокобацилла вызывает смертельную болезнь саранчи) сам может быть уничтожен другим ультрамикроскопическим паразитом. Он понимал, что у него в руках “конец ниточки”, которая могла привести его к цели, а именно, выявлению причин выздоровления при инфекционных заболеваниях.

Идея эта зародилась еще в детстве. Ему было 14 лет, когда мама после успешной сдачи им экзамена по математике дала ему 1000 франков. На эти деньги он купил себе велосипед и совершил турне по Европе. Однажды, в местечке Эпи, где он остановился позавтракать, он услышал разговор, как монахи аббатства Святого Хуберта (656-727 гг.) вылечивают людей от бешенства. Д’Эрелль расспросил очевидцев, посетил сам аббатство. Знакомство с этим “чудесным исцелением” определило всю его дальнейшую жизнь. Д’Эрелль прошел путь от микробиолога-любителя до профессионального бактериолога, во всем стараясь следовать Луи Пастеру [2]. 

C 1911 г. он начинает работать в институте Пастера в Париже. После опубликования его статьи о коккобациллах, как средства борьбы с саранчой, его стали приглашать для проведения таких работ в Аргентину, Турцию, Алжир, Корсику и даже во время войны в Тунис. Работая с культурами коккобацилл при проведении этих мероприятий,  Д’Эрелль снова наблюдал эти испещренные мелкими пятнами агаровые культуры. Но он не мог тогда объяснить, чем вызван такой необычный лизис культуры [2].

С 1915 года, работая уже в должности руководителя лаборатории прививок Д’Эрелль, получил возможность наблюлать за больными в инфекционной больнице истститута Пастера. Только тогла ему удалось уяснить природу явления, которое он назвал – бактериофагия.

Уже в своем первом сообщении о бактериофаге, опубликованном 10 сентября 1917 года в трудах института Пастера,  Д’Эрелль назвал “этот разрушающий бактерии принцип - бактериофагом” (пожиратель бактерий), и определил его как живое существо, способное самовоспроизводиться в живой микробной клетке. У него не было никакого сомнения, что это живой ультрамикроскопический вирус бактерий, и все свои усилия Д’Эрелль направил на исследование роли бактериофага при инфекционных болезнях человека и животных с тем, чтобы с его помощью искусственно вызывать выздоровление.

Д’Эрелль вспоминает: “…явление, которое я обнаружил, вызывало в окружющем мире только смех. В течение нескольких лет на меня смотрели одни – как на фантазера, другие – как на шутника… Мои коллеги по институту Пастера, которым я показывал культуры со стерильными пятнами и бульоны, где бактерии растворились, принимали это за редкое исключение или как какой-то фокус… В течение нескольких лет я был единственным, кто продолжал изучать это явление… и когда в 1921 году, наконец, признали, что все то, что я обнаружил, истинно, что все опыты, которые я описал, легко поддаются проверке, у меня было время, чтобы обнаружить все особенности явления…” [2].

Отношение к бактериофагу начало меняться к концу 1920 года и все началось со странной ошибки. Директор института Пастера в Брюсселе лауреат Нобелевской премии за 1919 год, Борде заинтересовался публикациями Д’Эрелля. Он направил своего помощника Куйска в Париж к Д’Эреллю за культурой E.coli. В это время Д’Эрелль был в Индокитае, но он оставил бактериофаги для раздачи, если кто попросит. Они стояли в холодильнике лаборатории прививок в одном штативе с культурами микробов. Куйска, конечно, видел прозрачные пробирки. “Он, без сомнения, верил, - вспоминает Д’Эрелль, - что речь шла о хорошей шутке над которой все еще смеялся весь мир”. Он взял мутную пробирку с надписью “Coli kappe”, что означало, “кишечная палочка, зараженная бактериофагом”. В этой же пробирке находился бактериофаг, к которому этот микроб приобрел устойчивость.  Такие культуры Д’Эрелль назвал вторичными или “носителями фага”, мутантами.

Борде ввел эту культуру морской свинке и нашел там то, что ввел, сам не зная об этом.  Д’Эрелль писал: “Пренебрегая всем, что я опубликовал, он сделал из этого торопливое заключение, что разрушение бактерий вызвано принципом, находящимся в самих бактериях” [2].

В том же 1920 г. Бордэ и Куйска опубликовали полученные ими результаты. Студент Борде Андре Грация отыскал никем не замеченную ранее статью Творта от 1915 г. о стекловидном перерождении микрококков. Творт выдвинул две возможные гипотезы, объясняющие это явление: ферментная активность самой бактерии или вирус бактерии.

Борде и его коллеги стали развивать первую концепцию, что лизис бактерий вызван самостимулирующимся ферментом бактерий. И начались бесконечные дебаты [3]. Вопрос о природе бактериофага, вспоминает Д’Эрелль, “стоял на повестке дня всех лабораторий мира”. Не менее жаркие споры начались и о приоритете на открытие бактериофага. По этому поводу Д’Эрелль привел высказывание Пастера, что открытие проходит через три фазы: вначале говорят “этого не может быть”, затем “это не его” и наконец, “это было так просто, что каждый мог это найти” [2].

Когда в начале 1921 г.  Д’Эрелль вернулся из Индокитая, его лаборатория была отдана другому без его оповещения, хотя ставку руководителя лаборатории за ним сохранили. Д’Эрелль вспоминает: “Мой друг Прозеровский дал мне некое подобие обеденного стола в углу своей маленькой лаборатории. Именно здесь я познакомился с молодым грузином Жоржем Элиавой, который вначале был моим помощником, затем стал моим другом”. Вместе они исследовали литические ферменты бактериофагов – лизины [2]. В это же время Д’Эрелль начал писать свою первую монографию, которая была издана в том же году в институте Пастера [4]. Эта работа не только заложила фундамент науки о бактериофагах, она фактически создала каркас всего здания будущей науки.

Заканчивая исторический обзор в этой монографии, Д’Эрелль пишет: “Почти всякому бактериологу при случае приходилось наблюдать упомянутые удивительные явления, но никому не пришло в голову, что перед ними феномен особой важности и никто не изучил этих явлений подробно”. В своей первой монографии Д’Эрелль объединил все исследования по фагу, проведенные им в 1915-1921 гг. Разработанные им методы работы с бактериофагами, а именно: техника выделения бактериофагов, определение и усиление вирулентности, давно ставшие классическими, описаны в мельчайших деталях, так что их очень легко воспроизвести. Один из основоположников молекулярной генетики Эллис, следуя оригинальным методам, предложенным Д’Эреллем, выделил из сточных вод г.Пасадена (Калифорния, США) бактериофаг и размножил его на кишечной палочке E.coli [3].

В ноябре 1921 г.  Д’Эрелль был приглашен тремя профессорами в Лейденский университет, где он занимался, главным образом, теоретическими исследованиями, связанными с природой бактериофага. В затянувшемся на десятилетия споре о природе бактериофага главным был вопрос: бактериофаг – это живое существо или не живое.
 
Д’Эрелль писал: “Мы не можем еще дать точного определения состояния жизни и это потому, что мы не знаем точно закономерности той игры физико-химических сил, которая придает материи свойства живого существа. Но мы можем с уверенностью сказать, подходя к определенному телу, живо оно или инертно”.

Основное свойство живой материи – это метаболизм (обмен веществ) и на его основе ассимиляция и самовоспроизведение.  Д’Эрелль разработал методы определения количества бактериофагов, как на агаровых культурах, так и в жидких средах, которые уже давно стали классическими. Стерильные пятна на агаровых культурах микробов являются наглядным свидетельством корпускулярной природы фагов. Каждое отдельное пятно – это колония из бактериофаговых телец, размножившихся из одного фага, а в ряду разведений бактериофага в пробирках, каждое конечное разведение (а оно может достигать 10 , т.е. в несколько сотен миллиардов раз), в котором наблюдается просветление культуры, свидетельствует о том, что там есть хотя бы одна частица фага, которая размножилась и лизировала микробы.

В своих воспоминаниях Д’Эрелль описывает встречу с Эйнштейном, которая состоялась в Лейденском университете. Эйнштейн, по словам Д’Эрелля, “был живой энциклопедией. Его интересовало все. Он достаточно знал о бактериофагах и в беседе, которую мы вели, он сразу затронул его внутреннюю природу”. Эйнштейн спросил, можно ли ему представить доказательства, что бактериофаг состоит из частиц, растворенных в жидкости. “В комнате, где мы находились, - вспоминает Д’Эрелль, - была лаборатория, и я совершил упрощенный показ, демонстрируя опыт крайних разведений”. Эйнштейн сказал: “Наконец, я нахожу биолога, который основывает свои доказательства на физических опытах. Ваш показ мне кажется убедительным, и я не могу понять, кто те биологи, которые его не понимают” [2].

Для изучения литического цикла бактериофага Д’Эрелль использовал очень простой метод: соединял бактериофаг с бактериальной эмульсией и через каждые 5 мин определял содержание бактериофага в центрифугате. При высокой активности фага через несколько минут практически весь фаг адсорбировался микробными клетками, и в жидкости оставалось свободного фага менее 1%. Проникая в бактериальную клетку, бактериофаг вырабатывает лизины, что позволяет ему ассимилировать бактериальную субстанцию и воспроизводить себе подобные фаги. Выход готовых фагов в жидкость происходит в виде взрыва. Максимальный выход фага из одной клетки у тифозной палочки, в опыте Д’Эрелля, составил 87 фагов через 12 мин после добавления литического начала. Эта величина зависит от вирулентности фага, штамма бактерий и условий опыта.  Д’Эрелль предлагал определять вирулентность бактериофага по скорости фаголизиса и описал методику, применяемую Сертичем и Булгаковым в его лаборатории в Париже (основана Д’Эреллем в 1928 г) [1]. Для приготовления лечебных бактериофагов желательно брать только высоковирулентные фаги, которые удваивают свое количество не более чем через 10 мин после контакта с бактериями.
Все споры о природе бактериофага закончились в 1940 г. После изобретения электронного микроскопа, одним из первых его применений была визуализация бактериофага и его взаимодействия с микробной клеткой. Это подтвердило корпускулярную природу бактериофага, как живого существа.

Другим самым главным свойством живых существ является способность к адаптации. Биологический закон таков: чем проще устроен организм, тем легче он адаптируется. Уже в своих ранних оытах с бактериофагом  Д’Эрелль отметил, что одной из существенных особенностей бактериофага является изменчивость, какой нет у других живых существ. У некоторых выздовавливающих больных удавалось выделить бактериофаг, который действовал на большое количество кишечных палочек, на многочисленные штаммы тифозной палочки, на все дизентерийные бактерии. Пассируя бактериофаг на какой-нибудь одной культуре, можно значительно повысить его вирулентность к этой культуре. Вирулентность к другим микробам может быть ослаблена или совсем утрачена. Современными исследованиями такая адаптация показана на генетическом уровне [5]. По способности к адаптации бактериофагам нет равных. В своей последней монографии Д’Эрелль приводит многочисленные опыты по адаптации фагов к различным факторам: pH среды, температурам, антисептикам и даже к антифаговым сывороткам, которые могут разрушить или нейтрализовать действие бактериофага. Такие антитела находят иногда в крови у людей, которым ни разу не вводили бактериофаг [1,6]. Безусловно, лечебные препараты бактериофага, адаптированные к антифаговой сыворотке, были бы очень востребованы при лечении хронических стафилококковых заболеваний (остеомиелит, рецидивирующий фурункулез). По способности к адаптации фаги отличаются друг от друга. Так для выработки у фагов устойчивости к антифаговой сыворотке для одной расы фагов пришлось провести 60+80 пассажей, а с другой расой фага Николай Булгаков получил бактериофаг, устойчивый к сыворотке в разведении 1:2 (первоначально антифаговая сыворотка нейтрализовала бактериофаг в разведении (1:3500) за 22 пассажа. Несмотря на то, что вирулентность бактериофагов можно повысить пассированием,  Д’Эрелль рекомендовал для лечебных препаратов использовать бактериофаги, которые уже в момент выделения высоковирулентны и обладают широким диапазоном действия. В его Парижской лаборатории было выделено несколько тысяч разных рас фагов и все они отличались друг от друга.

По мнению Д’Эрелля не существует бактерий, к которым нельзя было бы выделить вирулентный бактериофаг: “устойчивые к действию бактериофага формы, это наследственные носители бактериофага”. Они легко образуются как в природных условиях, так и в эксперименте.  Д’Эрелля удивляло “не то, что существуют штаммы, носители бактериофага, а то, что не все бактерии являются его носителями”.

Уже в 1920 г. Д’Эрелль опубликовал статью о приобретении бактериями резистентности к бактериофагу, сопровождающуюся изменением их свойств [7]. Он назвал эти культуры вторичными, потому что они иногда появлялись в прозрачных фаголизатах после нескольких дней выдержки при комнатной температуре. При изучении азиатской холеры в Индии (1927 г.) Д’Эрелль наблюдал появление таких бактерий фагоносителей in vivo, и все они были авирулентными, фагоносители тифозной палочки всегда были вирулентны. Эта проблема настолько заинтересовала Д’Эрелля, что он посвятил ей 5 лет (1929-1933 гг.) работы в Йельском университете (США). Результаты этих исследований с подробным описанием и протоколами опытов приведены в его последней монографии в главе “Симбиоз. Бактерия-бактериофаг” [1], а также в трех статьях по мутации (1932-1934 гг.), указанных в библиографии к этой работе. Непонятно, почему генетику бактерий начинают не с Д’Эрелля?

Для искусственного создания мутантов (бактерий фагоносителей) была использована музейная культура Salmonella enteritidis (из коллекции США), характеризующаяся очень стабильной вирулентностью и бактериофаг с высокой активностью к выбранному микробу. Основной опыт был заложен в декабре 1929 г. и заключался в следующем: 10 пробирок с бульоном (pH 7.6 не менее 10 мл) заражали одинаковым количеством одной и той же 18-ти часовой культурой сальмонеллы, тотчас же добавляли по одной капле активного тифозного бактериофага и оставляли при комнатной температуре. После начавшегося во всех пробирках интенсивного роста, через сутки содержимое всех пробирок было абсолютно прозрачно, через 20 дней 4 пробирки остались совершенно прозрачными, 6 пробирок помутнели в результате вторичного роста. Для дальнейших опытов была отобрана одна пробирка с нежным опалесцирующим ростом. Из нее сделали высев на 18 чашек Петри. С них было отобрано восемь вариантов мутантов, позднее добавили еще два. Эти культуры пересевали ежедневно в течение 200 дней, а затем один раз внеделю в течение двух лет. Таким образом, каждый мутант прошел через 400 пассажей в течение 40 месяцев. Исследование свойств мутантов поводили через 10, 100, 150 дней и через 40 месяцев. У них исследовали: 1) чувствительность к исходному бактериофагу; 2) способность фильтратов их фаголизатов лизировать разные штаммы сальмонелл; 3) вирулентность в опытах на мышах; 4) агглютинационную и аглютиногенную активность; 5) отношение к комплементу в присутствии и отсутствии амбоцептора.

Мы привели лишь краткое описание опыта, для расшифровки которого потребуются усилия еще не одного пколения исследователей.   Д’Эрелль лишь констатировал факт, как “под воздействием одного бактериофага на один бактериальный штамм происходит образование, если не бесконечное, но лишь неопределенное количество мутантов”. Десять вариантов, взятых под наблюдение, были не единственными. В ходе работы появлялись новые, но их не учитывали в силу физической невозможности охватить все вариации. На исследование только этих вариантов потребовалось около 6000 чашек Петри. Сравнение между собой свойств различных мутантов показало, что каждое свойство варьирует независимо от всех остальных, и, по словам Д’Эрелля “представляет собой автономное, независимое целое”.

Исследование вируленности полученных штаммов-мутантов показало, что три штамма стали полностью авирулентными. У двух штаммов вирулентность сохранилась как у исходного штамма, однако, по другим свойствам они от него очень отличались. У двух штаммов вирулентность значительно снизилась, что отмечено и современными исследованиями при лечении бактериофагами животных [6]. И только один мутант оказался способным вызвать хроническую болезнь.

Взаимодействие бактерии с бактериофагом не только изменяет свойства бактерии, но и бактериофагов, входящих в состав новых симбионтов.

В 1950 г., спустя год после кончины Д’Эрелля, исследования группы Львова в Париже пролили свет на образование таких мутантов [8]. В отличие от литического цикла при лизогении бактериофаг, проникая в микробную клетку, остается в ней, фрагментируясь в хромосому или присутствуя в виде плазмиды. Такое латентное существование бактериофага называют профагом. Одна микробная клетка может содержать свыше десятка профагов [6]. На множественный симбиоз указывал уже Д’Эрелль, говоря “о том, что в этих случаях бактерия делается “носительницей” различных фагов, причем каждый бактериофаг, наслаивающийся на предыдущий симбиоз, вызывает образование новых вариантов” [1].

Д’Эрелль считал, что главным условием проведения такого опыта является использование “ультрачистого” штамма микроба, т.е. не являющегося фагоносителем. Но уже одно то, что взятая им культура была патогенная, свидетельствует о том, что она являлась лизогенной и содержала, возможно, не один, а несколько профагов. Вот откуда такое многообразие вариантов.

Д’Эрелль делает заключение, что опыты, “приведшие к созданию новой экспериментальной бактериальной группы, дали нам, по нашему убеждению, ключ к уразумению естественного процесса образования групп и эволюции в бактериальном царстве” [1].

Все существующие гипотезы о происхождении бактериофагов можно условно разделить на две категории: гипотезы “созидания” и гипотезы “дегенерации”. Согласно последней, вирусы и фаги образовались в результате регрессивной эволюции от клеточных организмов в связи с их переходом на внутриклеточное паразитирование [8].

По мнению Д’Эрелля, “клеточная теория возникновения жизни представляет непреодолимое препятствие к происхождению жизни на земле. Клетка является уже чрезвычайно усложненным организмом, и нет возможности допустить появление на земле первого клеточного организма в результате одной только игры физико-химических реакций”.

В Йельском университете (США) Д’Эрелль занимал кафедру протобиологии и читал курс лекций по этой теме (1929-1933 гг.). В своей последней монографии, которую Д’Эрелль написал специально для ученых СССР (впервые опубликована на русском языке в Тбилиси в 1935 г.), он итожит все свои исследования по бактериофагу и излагает свой взгляд на происхождение жизни на земле. Он пишет: “В работе, опубликованной в 1924 г. я высказал гипотезу относительно того, что первичным живым началом должна была явиться аутотрофная мицелла, зарожденная в недрах серных источников. Мне даже удалось в одном из подобных источников (на французском курорте Challes-les-Bains) обнаружить протобактериальные фильтрующиеся формы серобактерий”. Одномицеллярные существа (протобы) не принадлежат ни к растительному, ни к животному цаству, но они дают начало плюримицеллярным существам двух типов: бактерии и спирохеты. От бактерий идут протофиты и растительный ряд, от спирохет – протозои и животный ряд.

Подобных же взглядов придерживался и наш соотетечественник А.И.Опарин, впервые высказав их в 1924 г. и затем изложив в монографии “Происхождение жизни на земле” (1936 г.), получившей мировую известность [3,8].

Но если, по словам Д’Эрелля, отвлечься от внешних форм проявления жизни, единый закон лежит в основе жизненных процессов, касается ли это человека, микробной клетки или бактериофага”.
 
Доклад на конференции "Дельфис" март 2017 г.
 
                ЛИТЕРАТУРА


1. Д’Эрелль Ф. Бактериофаг и феномен выздоровления. Тифлис. 1935.
2. Д’Эрелль Ф. Перипетии бактериолога (воспоминания).  Париж. 1940. – архивы института Пастера.
3. Summers W.C. Bacteriophage discovered, in Felix d’Herelle and the Origins of Molecular Biology, Yale University Press, New Haven, CT, 1999.
4.Д’Эрелль Ф. Бактериофаг и его роль в иммунитете. 1921.(русск. перевод 1925 г).
5. Crill W.D., Wichman H.A., Bull J.J. Evolutionary reverals during viral adaptation to alternating hosts genetics (USA). 2000. 154. №1. с. 27-37.
6. Бактериофаги. Биология и практическое применение. Сборник под ред. Е.Каттер и А.Сулаквелидзе. М.: Научный мир. 2012.
7. Herelle F.D. Sur is resistance des bacteries a l’action du Bacteriophage. C.R.Soc.Biologie. 1920. 83, 97.
8. Адамс М. Бактериофаги. М. Изд-во иностранной литературы. 1961.