Размышления о бактериофагах. Часть 1

Часть I. Первое знакомство с бактериофагами

1. Вкус, знакомый с детства

Чего больше всего боятся дети? Да, конечно же, уколов. Когда в детском садике нам объявили, что нужно идти к врачу, вереница трясущихся от страха ребятишек вытянулась вдоль коридора. Но вот раздался чей-то радостный крик: «Не уколы, а водичка», - это первые смельчаки вышли от врача. Удивительно, ведь за годы посещения детского сада, мне, конечно не раз приходилось бывать в кабинете врача. Но почему-то запомнился только этот визит. Небольшая комната с одним окном. В глубине комнаты прямо напротив двери небольшой стол, за которым сидит врач и что-то записывает, а сбоку медсестра наливает в столовую ложку жидкость желтого цвета и дает очередному ребенку.

Когда спустя много лет мне довелось попробовать бактериофаг, я сразу же узнала этот вкус. Это была та самая “водичка”, которая принесла столько радости детям. В последние годы войны Пермский институт вакцин и сывороток стал выпускать дизентерийный бактериофаг. Тогда нам, детям, давали его с профилактической целью.

2. Исцеление, похожее на чудо

Дочери было восемь месяцев, когда я дала ей обезжиренный кефир, купленный в магазине. На следующий день ребенок стал беспокойным, кал приобрел форму кашицы. Постепенно состояние явно ухудшалось. Мы перепробовали все имеющиеся у нас средства для нормализации кишечника, но ничего не помогало. Я оформила отпуск, чтобы быть постоянно с ребенком. На работе мне дали противодизентерийную сыворотку и колибактерин. Пока давала сыворотку (а мне ее хватило на два дня), понос остановится. Но как только сыворотки не стало, все снова повторилось. Понятно, ведь сыворотка только устраняет действие токсина, но микробы она не убивает. Колибактерин не только не помог, но вызвал резкое обострение болезни. Я пошла на крайние меры, попробовала дать антибиотик – левомицетин. Но из этого ничего не вышло, ее тотчас же вырвало. Больше уже не на что было надеяться. Я взяла направление в больнице и сдала кал на анализ.

Уже на следующий день пришли работники из санэпидстанции, осмотрели квартиру. Так как ребенок изолирован, в больницу ложиться не обязательно. То, чего я так боялась, потом само собой разрешилось.

Чем бы закончилось наше лечение неизвестно, если бы я не встретила по пути в больницу, свою знакомую и рассказала ей о своих мучениях. “Не волнуйся, - сказала она, -у моего сына недавно была такая же история. Мне привезли из Горького (Нижнего Новгорода) бактериофаг и все сразу же прошло”. Вечером у меня уже был бактериофаг. Я сделала все, как она научила меня. Давала по одной столовой ложке в 12 часов ночи и в 6 часов утра, так в течение целой недели. Но уже одной ложки было достаточно, чтобы все наши страдания закончились. Даже не верилось, что такое возможно. В наставлении к препарату (это был коли-протейный бактериофаг, флакончик на 100 мл) перечислялись микробы, на которые действует данный бактериофаг. Была в этом перечне и наша злосчастная кишечная палочка O-124, выявленная при баканализе. Она относится к дизентерийноподобному типу. Вот почему таким тяжелым было заболевание, и почему противодизентерийная сыворотка дала лишь временное облегчение. Однако эффект от применения бактериофага был просто поразителен. Но я этому особого значения не придала. Ведь написано же в наставлении, что бактериофаг убивает бактерии и уже его название говорит само за себя – “пожиратель бактерий”. Такое название дал ему Д’Эрелль в 1917 году. Именно Д’Эреллю принадлежит заслуга в разработке лечебных бактериофагов, и он считал их идеальным средством для лечения детских поносов. Уже свою первую монографию (1921 год) Д’Эрелль заканчивает словами: «При любой тяжелой инфекционной болезни лечение бактериофагом должно начинаться без малейшего промедления… бесцельно и опасно ждать результатов лабораторных исследований для подтверждения клинического диагноза. Одна лишь мысль об инфекции уже дает нам право назначать бактериофаг… инъекция или прием внутрь любого бактериофага совершенно безвредно. В случае диагностической ошибки даже введение авирулентного по отношению к данной болезни бактериофага может быть полезным». И эти слова следует выделить курсивом в учебниках по терапии инфекционных заболеваний. Но, увы, в перечне лекарств, выписанных нам врачом, бактериофаг не значился.

3. Факты, привлекшие мое внимание к бактериофагу

Во время войны во Вьетнаме (1965-1975 годы) в СССР был разработан комплексный препарат для активной иммунизации воинского контингента от ботулизма, столбняка, газовой гангрены. В производстве этого препарата было задействовано несколько предприятий. Пермский НИИ вакцин и сывороток должен был настроить промышленный выпуск анатоксинов перфрингенс и эдематиенс (возбудители газовой гангрены), на основе уже имеющихся лабораторных регламентов. Первым этапом производства анатоксинов является получение токсинов путем культивирования соответствующих микробов в жидких средах. При получении токсина перфрингенс особых трудностей не возникло. Но получить токсин эдематиенс оказалось не так просто. Удивительно, но первый опыт по воспроизведению лабораторного регламента прошел вполне успешно. Был получен токсин, отвечающий нормативным требованиям. Это было в апреле 1968 года, а в мае микробов как будто подменили, они росли, а токсин не образовывался. При жестком соблюдении регламентированных условий выращивания, использовании одной и той же микробной культуры мы не могли воспроизвести наших первых опытов. И так продолжалось 2 месяца. И вот, наконец, в июле токсин пошел, причем по нарастающей, когда в каждой новой серии он был выше, чем, в предыдущей. Так продолжалось до сентября, а потом активность токсина пошла на спад, также плавно, но по убывающей. Такие сезонные колебания активности токсинов мы наблюдали и в последующие годы, когда перешли на промышленное культивирование микробов в больших емкостях.

Самый большой сюрприз ждал нас осенью 1971 года, когда активность токсинов от максимальной 20000 Dlm/мл в предыдущие годы доходила до 60000 Dlm/мл. Это повторилось и в последующие два года. Такая сезонность характерна для кишечных заболеваний (холера, дизентерия и др.). За что эпидемиологи называют их болезнями “грязных рук и немытых фруктов”. Но в условиях производства, где все параметры строго регламентированы, приходится искать другую причину.
Интересно отметить, что осенью 1971-1972 годов, когда образование токсинов было столь велико, что пена не входила в реактор (показатель высокого уровня токсинообразования, видимый даже визуально), в южных районах нашей страны повсеместно отмечали вспышки холеры, которая в те годы дошла даже до Уфы. В 1974 году активность токсинов значительно ослабела. Продолжить наблюдения не представилось возможным, так как с 1975 года производство было переключено на выпуск другого препарата – стафилококкового анатоксина.
 
При культивировании стафилококка таких резких скачков в уровне накопления токсина (почти в 20 раз) не наблюдалось, и сезонность была более сглажена, хотя стабильностью процесс токсинообразования не отличался.

Особенно высокий уровень токсина был в апреле-мае 1985 года, а потом опять токсин пошел на убыль. Единственно, чего мы старались избегать при культивировании стафилококка – это дней с повышенной солнечной активностью.
Выраженная сезонность характерна не только для инфекционных заболеваний, продуктивности микробов, но она была обнаружена Дж.Пиккарди и в поведении водных (коллоидных) растворов некоторых солей. Пиккарди высказал мысль, что такое поведение растворов связано с движением Солнца и Земли вокруг центра Галактики. Движение Земли в межзвездном пространстве сложное. Оно складывается из ежегодного обращения Земли вокруг Солнца и совместного полета вместе со всей Солнечной системой вокруг центра Галактики. “Ежегодно в марте Земля летит почти прямо к центру Галактики с максимальной скоростью 45 км/сек. Осенью же, в сентябре, скорость Земли направлена почти перпендикулярно к прежнему, “мартовскому” направлению, и при этом достигает минимума – 24 км/сек”.

Разгадка столь странного явления пришла совершенно неожиданно. Готовясь к сдаче экзамена по кандидатскому минимуму по микробиологии, я тщательно штудировала всю рекомендованную литературу. И вот в монографии М.Адамса “Бактериофаги” (1961 г.) я нахожу, что токсинообразование дифтерийных микробов связано с лизогенией, когда в геном фрагментирован бактериофаг (профаг). С утратой профага культура становится не токсигенной. Феномен токсигенной конверсии, открытый Фриманом в 1951 г., впоследствии был воспроизведен другими исследователями и для возбудителей ботулизма, столбняка, стафилококка, стрептококка, кишечной палочки, холеры, сальмонелл. И с каждым годом количество патогенных микроорганизмов, у которых такая связь обнаружена, постоянно пополняется. Именно лизогенное состояние делает микробы столь чувствительными не только к условиям среды обитания, но и к космическим. Ведь недаром для прокладки будущих трасс полета космических кораблей использовали лизогенную культуру кишечной палочки E-Coli K-12. О вспышке на солнце она сигнализировала раньше, чем любой искусственный прибор. В небольшой статье даже вкратце невозможно описать проблему связи микроба с бактериофагом. Подступы к ней дал Д’Эрелль уже в самых первых своих опытах, которые собственно и предваряют современные исследования. Но обо всем этом я узнала значительно позднее, когда с 1994 г. начала работать с фагами. Удивительно, но за 10 лет работы в производстве лечебных бактериофагов не было никаких срывов, той вариабельности, которую мы отмечали в процессе токсинообразования (сезонные и цикличные колебания). Да и сам процесс получения анатоксина был более длительным и трудозатратным. Бактериофаг всегда лизировал микробы до полного просветления (прозрачности) среды как в пробирках, бутылях, так и в реакторах. И конечно, это наиболее экономичный вариант производства, предложенный нам Д’Эреллем.

Д’Эрелль оставил после себя не только монографии, но и воспоминания, в которых достаточно полно освещен весь путь его поиска. К 100-летию открытия бактериофага Д’Эреллем мы попытались обобщить весь этот поиск и в 2019 г. издали книгу “История открытия и исследования бактериофага Д’Эреллем” (ISBN 978-5-90363-240-4). В этом году к 150-летию со дня рождения Д’Эрелля я разместила полный текст книги в интернете на своей странице proza.ru.
В этой статье я попыталась затронуть лишь одну проблему – взаимоотношения фага и бактерии. По словам Д’Эрелля она настолько сложна, что он на протяжении всей своей жизни возвращался к ней неоднократно.
       
4. Д’Эрелль – основатель науки о бактериофагах

Д’Эрелль не только заложил фундамент будущей науки, но и создал каркас всего здания, верхних этажей которого современная наука еще не достигла. Первые 5 лет (1917-1921 гг.), когда он один исследовал бактериофаг в институте Пастера в Париже, и над ним смеялись, как над фантазером, были самыми плодотворными в его жизни. Ему никто не мешал, чего не удалось избежать в будущем, когда почти 20 лет ему приходилось доказывать, что бактериофаг все же живое существо. В своей первой монографии (1921 г.), он даже не заострял на этом свое внимание, настолько все было очевидно. Даже Альберт Эйнштейн был удивлен, не понимая, вокруг чего идет спор. Споры прекратились только в 1940 г., когда после изобретения электронного микроскопа, одним из первых его применений была визуализация бактериофага и его взаимодействия с микробной клеткой. Это подтвердило корпускулярную природу бактериофага, как живого существа.

И с этого момента начинается  новая волна исследований бактериофага уже на молекулярном уровне.  Д’Эреллю мы обязаны появлением впоследствии таких наук как молекулярная генетика и молекулярная биология.

В своих первых исследованиях Д’Эрелль заметил, что помимо литического цикла, когда бактериофаг проникая в микробную клетку, размножается в ней и разрушает ее, производя себе подобные фаги, возможен и другой исход взаимодействия фага с бактерией, а именно, проникшие в бактериальную клетку фаги “сохраняются в латентном состоянии внутри бактерии”. Он даже высказал предположение о возможной их гибели, однако, образование вторичных культур свидетельствовало о более сложном механизме этого взаимодействия. Вторичными культурами Д’Эрелль называл микробы, которые приобрели устойчивость к действию фага, от которого произошли. Позднее он стал называть их мутантами, так как с приобретением устойчивости к бактериофагу они стали очень отличаться от исходной культуры и по другим свойствам. “Об изменении свойств, которые происходят у бактерий”, - пишет Д’Эрелль, - “знали уже давно, но игнорировали причину этого явления. Я показал, что эти изменения были реальны и что они всегда были результатом хронического бактериофага”. Изучению этой проблемы Д’Эрелль посвятил 5 лет работы в Йельском университете (США) в течение 1929-1933 годов. По его собственным словам, эта тема слишком сложна, чтобы можно было войти в детали проведенных опытов, таклй же сложной она остается и на сегодняшний день.

В своей последней монографии “Бактериофаг и феномен выздоровления” Д’Эрелль обобщил все свои исследования по бактериофагам, проведенные им за 20 лет во Франции, Индокитае, Голландии, Египте, Индии, США и СССР. На основании своих наблюдений и экспериментов он убедительно доказал, что исход любой инфекционной болезни зависит от наличия и поведения бактериофага, также как и затухание эпидемии. Фаготерапию, в эффективности которой он никогда не сомневался, Д’Эрелль рассматривал как искусственно вызванное естественное выздоровление. Именно Д’Эреллю принадлежит разработка промышленного производства бактериофагов. В 1933 г. он приезжал в Тбилиси по приглашению своего друга грузинского микробиолога Элиава, с которым они вместе работали в институте Пастера в Париже. Д’Эрелль не только привез в Тбилиси необходимое оборудование, но и коллекцию собранных им и его сотрудниками фагов, некоторые из которых, возможно, и сейчас еще циркулируют в лечебных бактериофагах. Чем больше пересевов проходит бактериофаг, тем он становится более вирулентным, более активным. Именно к таким фагам относятся дизентерийный и стафилококковый бактериофаги.