Аннотация
Способ управления ростом микроорганизмов в процессе получения их массы пищевого и кормового назначения. Цель изобретения - стабилизация качества биомассы в процессе их культивирования. Для этого выращивают микроорганизмы на известных для них средах и периодической культуре. По мере увеличения их биомассы регистрируют такие концентрации всех питательных компонентов и одновременно с этим проводят анализ качественного состава клеточной массы. Все данные наносят на график, ось абсцис которого представляет время роста микробной культуры, а ось ординат - все определяемые концентрации. Выделяют те моменты времени, и которые имело место наиболее подходящий качественный состав клеточной массы и соответствующие ему концентрации питательных компонентов. Верхние и нижние значения концентрации питательных компонентов. Верхние и нижние значения концентраций питательных компонентов соответственно делят на нижние и верхние концентрации биомассы и, таким образом, устанавливают оптимальную область удельных концентраций компонентов питательной среды. Далее, в процессе, например, непрерывного выращивания микроорганизмов полученные величины используются в качестве критерия для управления процессом, то есть для поддерживания оптимальных условий качественного микробиосинтеза.
Физико-Химические параметры биологической среды и управление микробиосинтезом. Николай Васильевич Золотухин.
Управление жизнедеятельностью клетки (одноклеточного организма) является одной из центральных проблем биологии и её прикладных разделов, а также первостепенной технологической задачей промышленных производств в различных физиологических активных веществ микробного происхождения. Решение данной проблемы имеет большое значение не только для более глубокого понимания структурной и функциональной организации живой материи, но и для разработки соответствующих методов управления процессами жизнедеятельности на уровне клетки или клеточной популяции. Микробиологическое получение различных физиологически активных веществ, как известно, в настоящее время гораздо эффективнее химических способов. Тем не менее, в промышленном масштабе реализация микробиологических способов вообще проще и надёжнее. Это объясняется тем, что их прохождение в основном определяется внутренними факторами (параметрами), не доступными прямому, непрерывному измерению. Если в химических производствах основные параметры, например, концентрации ферментов, начальных промежуточных и конечных продуктов, а также рН, редокс потенциал и так далее, внутри клетки без разрушения биообъекта практически неопределяемы. В силу этого биологические процессы требуют иных способов контроля и тем более, управления. Очевидно, что те параметры, которые полностью обеспечивают течение химических реакций, в биологических процессах могут не быть определяющими, в ряде случаев полностью индиферентными к их изменениям. Например, прекращение роста клеток не обязательно сопровождается определёнными изменениями физико-химических параметров среды. В настоящем сообщении в общих чертах рассматриваются основы микробиосинтеза и роль физико-химических параметров среды в его управлении на примере модельного биологического объекта - водородных бактерий. Как известно жизнедеятельность микроба в первом приближении можно представить как совокупность энергетических и синтетических процессов, обеспечивающих размножение клеточных компонентов (биосинтез) которое завершается делением клетки. Эти процессы идут непрерывно при условии наличия в клетке определённых количеств энергии и элементов, из которых создаётся её структура. Всё это поступает в клетку в виде определённых веществ из окружающего её пространства, которые служат субстрактом для систем превращения вещества и энергии в соответствующие клеточные компоненты. Очевидно, что отношение количества аккумулированных веществ и энергии к количеству вновь синтезированной биомассы может характеризовать эффективность клеточного биосинтеза. Чем выше значение данного отношения, тем эффективнее процесс. Что касается качества вновь синтезируемой биомассы, то оно по-видимому определяется индивидуальными активностями всех ферментных систем клетки, и сопряжённостью различных синтетических реакций, имеющих связи через общие исходные, промежуточные и конечные продукты. Иначе говоря, качество создаваемой биологической массы характеризуется отношением элементов, из которых она состоит. Например, отношение указывает на то, что созданная биомасса не содержит азот- фосфоро содержащих веществ, то есть белков, нуклеиновых кислот и их предшественников. Таким образом, регулируя работу энергетической и синтетической систем, клетки и составляющих их подсистем, появляется возможность стабилизировать качество получаемой биологической массы. Для исследования внутренней функциональной организации клетки или одноклеточных организмов решающее значение имеет правильный выбор биообъекта. Среди известных одноклеточных организмов наиболее доступными ( в смысле получения информации о связях между энергетическими и синтетическими процессами) являются водородные бактерии, так как именно для них уже разработаны методы управления основными - процессами их метаболизма. При помощи данных методов у водородных бактерий были выявлены следующие закономерности. Скорость роста микробных клеток есть величина переменная даже внутри одного вида и она поддаётся регулированию. Выход биомассы на единицу израсходованного энергетического субстрата является переменной величиной и может принимать различные значения (положительные), включая и нулевые. Данная величина также поддаётся регулированию путём соответствующих воздействий на механизм холостого окисления субстрата и на его распределения. Перечисленные закономерности имеют место в широких диапазонах значений температуры, рН и окислительно-восстановительного потенциала питательной среды. Для удобства дальнейшего изложения рассмотрим в общем виде метаболизм клетки на примере водородных бактерий. На рисунке схематично представлены энергетическая и синтетическая системы данных микроорганизмов и исходные и конечные продукты. Как следует из данной системы данных микроорганизмов и исходные и конечные продукты. Как следует из данной схемы, жизнедеятельность водородных бактерий основана на поглощении элементарных веществ. аммиака и некоторых ионов) с последующим превращением их в соответствующие компоненты клетки. Данные превращения осуществляются энергетической и синтетической системами. Рассмотрим вкратце их работу. Энергетическая система у водородных бактерий принципиально не отличается от таковой, имеющейся в дрожжей и других одноклеточных организмов. Работа её в данном случае также сводится к высвобождению свободной энергии субстрата и превращению её в унифицированные формы, например в аденозинтрифосфат (АТФ). Субстратом для энергетической системы у водородных бактерий служит молекулярный водород, а например у дрожжей - углеводы или углеводороды, а вернее - их водород. В обоих случаях клетки получают от электронов водорода в процессе перемещения их по ниспадающим энергетическим уровням на кислород или другой акцептор. В ходе данного перемещения часть энергии электронной трансформируется в соответствующие биоформы, а также рассеивается в окружающее пространство в виде тепла и других электромагнитных излучений. Очевидно, что чем больше энергии субстрата будет превращено например, в химические связи АТФ, тем эффективнее работа энергетической системы: тем выше выход биомассы по энергии. Синтетическая система у водородных бактерий, как и у остальных организмов, представлена множеством элементарных реакций и их совокупностей, в результате прохождения которых создаётся материальная основа жизнедеятельности, то есть воспроизводятся все компоненты клетки. На схеме они указаны в виде веществ, состоящих соответственно из водорода, углерода, азота, кислорода и так далее. Очевидно что для синтеза данных соединений необходим непрерывный приток в систему веществ, служащих источниками соответствующих элементов и энергии, необходимой для их соединения в определённые структуры. Работа синтетической системы, как и энергетической, сопровождается соответствующими материальными и энергетическими потерями. В данном случае также вполне очевидно, условие эффективной работы синтетической системы. Следует подчеркнуть тот факт, что работа синтетической системы может быть эффективной даже при условии высоких материальных потерь, то есть даже при интенсивном выходе из клетки интермедиатов метаболизма, если в качестве целевого продукта рассматривать не только клеточную массу, но и сами продукты жизнедеятельности (витамины, аминокислоты, антибиотики, спирт и так далее). Поэтому полную эффективность работы синтетической системы того или иного объекта следует рассчитывать не только по массе но и по количеству компонентов утраченных объектом (клеткой) в ходе жизнедеятельности. Из сказанного следует, что целью управления микро биосинтезом является прежде всего обеспечение эффективной работы энергетической и синтетической систем микробных клеток. Для выполнения данного условия, очевидно, необходимо иметь информацию о связи между указанными системами. Рассмотрим это положение на конкретных примерах, без учёта влияния генетической системы клетки. По современным данным и общепринятым представлениям между энергетической и синтетической системами клетки существуют следующие связи. 1) Связь по общему субстрату. У водородных бактерий таковым является водород, у гетеротрофных организмов - сахара и другие вещества. 2) Связь по унифицированной форме энергии, например АТФ, продуцируемого энергетической системой. Интенсивность же работы энергетической системы (при прочих равных условиях) определяется скорость распада АТФ. В случае снижения данной величины до определённого уровня, в клетке происходит накопление АТФ. Это включает механизм, так называемого дыхательного контроля, который ингибирует реакции, синтезирующие АТФ. Это есть один из примеров отрицательной обратной связи в биологических системах. Снижение же концентрации АТФ снимает его ингибирующее действие на работу энергосистемы клетки и стимулирует дальнейшую работы. Иными словами, периодическое накопление АТФ выше критического уровня приводит работу энергетической системы клетки в колебательный режим. Синтетическая система при этом может работать в стационарном режиме. Как показывают исследования различных биологических объектов и явлений колебательные процессы широко распространены в живой природе и вполне вероятно, составляют основу для саморегулирования и самонастраивания живых систем. Следовательно разработки методов управления био процессами обязательно должны учитывать их колебательную природу и соответствующим образом реализовать их в процессе алгоритмизации. Роль же физико-химических параметров среды ( в определённых областях их значений) в данном случае сводится к нулю или к определённому минимуму. Рассмотрим это положение на конкретных примерах. На рисунке 2 показан рост водородных бактерий при различных значениях температуры и концентраций углеродного субстрата и кислорода. Эти данные показывают, что в присутствии углекислоты рост водородных бактерий идёт непрерывно, не смотря на значительные колебания температуры среды. Следовательно жёсткая стабилизация температуры среды. Следовательно жёсткая стабилизация температуры среды. Следовательно жёсткая стабилизация температуры среды. Следовательно жёсткая стабилизация температуры в данном случае не является обязательной. При остановке роста (из-за отсутствия углеродного субстрата или ингибирования микробиосинтеза избытком кислорода в присутствии всех питательных компонентов в оптимальных количествах) любые температурные изменения не стимулируют рост бактерий. Следовательно, остановку и пуск микробиосинтеза можно осуществить путём соответствующего воздействия на внутриклеточные механизмы, вполне определённым способом. Аналогичным образом ведут себя дрожжи, для которых также изменения температуры от 20 до 38 градусов С не вызывают снижения их синтетической активности (также при прочих равных условиях). Здесь уместно также отметить, что уменьшение концентрации углеродного субстрата в 1,5-2 раза снижает биосинтетическую активность водородных бактерий в 10 и более раз. Повышение же парциального давления кислорода на несколько процентов значительно подавляет рост бактерий вплоть до полной остановки. Аналогичное действие кислорода на несколько процентов значительно подавляет рост бактерий вплоть до полной остановки. Аналогичное действие кислорода, как известно, проявляется и на других организмах. На рисунке 3 приведены данные по независимости роста водородных бактерий от рН среды в областях 6,8 - 10 единиц. Подщелачивание среды в данном случае производили добавкам аммиака, а подкисление, то есть теми кислотно-щелочными компонентами, которые к тому же, являются элементами питания клеток. Из этих данных также не следует адекватность изменений физико-химической активности микробных клеток. Очевидно, что всем изменениям рН за счёт добавок, например, в отсутствии в среде будет однозначно соответствовать постоянство скорости роста микробов, численно равной нулю. Приведённые выше факты говорят о том, что на фоне меняющегося рН среды в клетке проходят все реакции, необходимые для её роста и давления. И наоборот, при самых "оптимальных" значениях рН не только отдельные системы, но вся клетка может не работать. В самой же клетке, вероятно, имеются возможности либо нейтрализовать действие рН среды собственной буферной ёмкостью или другим способом, либо внутриклеточные реакции в целой клетке вообще не чувствительны к изменениям рН в широком диапазоне. Поэтому в данном случае, также нет оснований для категоричных утверждений о непосредственной связи между значением рН окружающей среды и кинетикой внутриклеточных реакций. Этот параметр также не является прямым в регулировании внутриклеточных реакций и управлении процессами жизнедеятельности клеток. На рисунке 4 приведены изменения редокс потенциала среды и биосинтетической активности водородных бактерий на фоне изменяющихся рН. В данном случае изменения потенциала полностью определялись концентрациями кислорода и водорода в среде. Эти данные указывают на то, что редокс потенциал, как таковой, также не может служить "каналом" имеющим непосредственную связь с ходом внутриклеточных процессов и, тем более, служить параметром, селективно влияющим на отдельные реакции или их совокупность. Приведённые данные дают основание сделать соответствующий вывод. Значения температуры среды, концентрации в ней ионов её окислительно-восстановительные свойства в определённых областях их значений не имеют непосредственного отношения к закономерностям прохождения внутриклеточных процессов и реакций. Поэтому они не могут быть "опорными точками" в разработке и создании методов управления микробиосинтезом на уровне клетки, или, что всё равно, растущей клеточной популяции в промышленном аппарате. Эта также подтверждается многочисленными экспериментальными данными, получаемыми как в лабораториях, так и в условиях производства. Следовательно, основу управления микробиосинтезом могут составить только те методы, которые отражают и учитывают течение внутриклеточных реакций и процессов в их взаимозависимости и взаимосвязи. Таковыми, в частности, являются методы управления сложными динамическими системами, то есть методы кибернетики. Именно кибернетический подход к проблеме управления управления био процессами, вероятно может стать наиболее продуктивным и перспективным так как он базируется на понятиях отражающих динамическую природу процесса и требует обязательного выявления всех связей между отдельными его звеньями или подсистемами. Кроме того, кибернетика располагает высокопроизводительными средствами анализа, моделирования и управления процессами независимо от их природы.
Литература
1. Бауер Э.С. Теоретическая биология М.-Л. 1935 г.
2. Винер Н. Кибернетика. М. "Советское радио" 1958
3. Золотухин Н.В. Рост водородных бактерий при меняющихся концентрациях водорода и кислорода. Из АН СССР сер. биологии N3 1969г.
4. Золотухин Н.В. Научные доклады высшей школы. биол. науки 8 1969г.
5. Золотухин Н.В. Исследование хемосинтеза у водородных бактерий условиях управляемого газового питания. Кандидатская диссертация Пущино на Оке 1970г.
6. Золотухин Н.В. Биофизика № 1 1972а
7. Золотухин Н.В. Биофизика № 4. 1972б
8. Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов М., 1963
9. Иерусалимский Н.Д. В сб. "Управляемый биосинтеза" Наука. М. 1966.
10. Чернавский Д.С. Иерусалимский Н.Д. 1966. Там же.
11. Кальве, Прат. Микрокалориметрия. ИЛ, 1963
12. "Колебательные процессы в биологических и химических системах" Сб. матер. всесоюзного симпозиума. Пущино на Оке 1967
13. Ленинджер Митохондрия. ИЛ 1966
14. Пасынский А.П. Биофизическая химия, "Высшая школа", М., 1968
15. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий (рН и 2Н2) в жизнедеятельности микроорганизмов. Изд. АН СССР, М. 1957
16. Сент-Дьердьи. Биоэлектроника. "МИР" М., 1971.
Фиксация углекислоты развивающейся популяцией водородных бактерий.
Описан метод определения расхода и кинетики потребления СО2 растущей популяцией водородных бактерий. Метод основан на титровании суспензии растущих бактерий двуокисью углерода. Увеличение содержания растворённой СО2 и её потребление бактериями Hydrogenomonas Z=1 регистрировали по рН. Показано, что потребление СО2 бактериями НYZ=1 пропорционально росту биомассы. Причём, наиболее интенсивное включение СО2 происходит в лаг- и начале логарифмической фазах роста популяции. В отсутствие кислорода и при 30% его содержания в газовой смеси фиксацию СО2 бактериями НYZ=1 не наблюдали. Хемосинтетическая фиксация углекислоты водородо окисляющими бактериями изучалась многими авторами (Лебедев, 1910; Беляева, 1950; Schatz, 1952; Marino, Clifton, 1955; Packer, Vishniac, 1955; McFadden, Atkinson, 1955, 1957; Bergman etal, 1958; Zechtman etal, 1963, и другие). В ранних работах потребление СО2 водородными бактериями определяли из общего расхода газовой смеси за время роста (Лебедев 1910). Такой метод давал представление лишь об изменении начального состава газовой смеси и о количестве использованных Н2,О2 и СО2 за определённый промежуток времени. В более поздних работах по водородным бактериям для изучения потребления газообразных компонентов были применены методы газовой хроматографии (Zechtman etal, 1963), монометрии (Schatz, 1952) и радиоактивных изотопов (Bergman etal 1958). Этими методами в основном пользуются и сейчас. Методами монометрии и радиоактивных изотопов исследования обычно проводят на покоящихся клетках и бесклеточных препаратах водородных бактерий. Газовая хроматография применяется при длительном выращивании этих бактерий. Газовая хроматография применяется при длительном выращивании этих бактерий. Этот метод позволяет контролировать изменения газовой смеси за определённые промежутки времени. Исследования с применением данных методов показали, что фиксация СО2 проходит только при наличии кислорода и осуществляется реакциями пентозофосфатного цикла. Причём, этот процесс протекает всегда при Н2/O2 > 2. Настоящая работа посвящена изучению процесса фиксации СО2 растущей популяцией водородных бактерий в зависимости от фазы роста и физиологического состояния клеток.
Материалы и методы.
В опытах использовали активный штамм Hydrogenomonas Z-1, выделенный в Отделе физиологии хемосинтезирующих микроорганизмов ИНМИ АН СССР. Для выращивания данного штамма их применяли минеральные среды следующего состава (г/л): Среда №1 (рекомендованная Шлегелем Schlegel, etal, 1961): NaHPO4 - 9,0; KH2PO4- 1,5; NH4Cl-1,0; MgSO4-0,2; NaHCO3-0,5; CaCl2- 0,02, Fe (NH4) C6H5O7- 0,012 и микроэлементы Хогланда. Среда №2. KH2PO4 - 0,5; K2CO3-0,4; NaHCO3-0,6; H4CL-0,8; MgSO4-0,2, остальные компоненты те же, что и для среды №1. Среда №3. NaHPO4-6,0; KH2PO4- 0,6; остальные компоненты те же, что и для среды №1. Электроды. В качестве электрода сравнения применяли электрод марки ХСР 5268\ ЗИП, Гомель и рН-электрода - электрод марки ЭСЛ-11-04. Стерилизацию сред проводили в автоклаве при 1 атм. избыточного давления. Чистоты культуры проверяли путём высева проб на чашки с картофельным агаром. Изменения биомассы определяли по сухому весу или по оптической плотности на ФЭК-58 при длине волны 660 ммк. Расход СО2, O2 и Н2 определяли путём прямых измерений объёмов этих газов, подаваемых в реактор. Для этой цели использовали мерные цилиндры, соединённые системой резиновых шлангов и кранов с реактором и резервуарами с Н2, O2, и CO2. Определение углекислоты. Поскольку потребление газообразных компонентов при выращивании водородных бактерий на жидких средах происходит в жидкой фазе, нами была поставлена задача регистрации изменений именно растворённой СО2 в жидкой фазе реактора, то есть непосредственно в бактериальной суспензии. В основу нашего метода определения углекислоты были положены работы по определению СО2 в жидкой фазе по рН ( Spruit a. KOK, 1956, Siggard-Andersene.a., 1960). 1/ конечными продуктами хемосинтеза водородных бактерий являются клетки и вода. 2/ концентрации минеральных компонентов среды с увеличением биомассы только уменьшаются. 3/ можно подобрать такую минеральную среду, кислотно-щелочные свойства которой будут определяться содержанием в ней углекислоты не зависимо от концентрации бактерий. 4/ в геометрическом реакторе уменьшение содержания СО2 в жидкой и газовой фазах пропорционально росту бактерий и изменению рН.
Результаты и обсуждение.
Для проверки упомянутых допущений нами были проведены различные опыты со средами без бактерий и с растущими бактериями. На рис.1 показаны изменения рН при продувке сред смесью 80% Н2 + 10% О2 + 10% СО2. Из этих данных видно, что при высоком содержании фосфатов в среде и, следовательно, большой буферной ёмкости смещение рН меньше, чем при малых значениях этих величин. Аналогичные результаты были получены и с суспензией растущих бактерий (рис.2 и 3). Кроме того, было установлено, что независимо от содержания фосфатов отклонение рН тем больше, чем больше СО2 в газовой фазе реактора (рис. 2 и 3), а расход СО2 возрастает с увеличением концентрации клеток. Изменения режима поступления СО2 в реактор рН меняется в ответ на добавление этого газа и потребление его клетками. Постоянное поступление СО2 в смеси с Н2 и О2 не приводит к изменениям кислотно-щелочных свойств среды (рисунок 4, участок АВ). Исключение СО2 из газовой смеси вызывает повышение рН (рисунок 4, участок ВС). Значит 10% СО2 в газовой смеси полностью потреблялись бактериями с той же скоростью, которой поступал этот газ. По мере увеличения биомассы в среде изменения рН при добавлении одного и того же количества СО2 в реактор повышаются. Можно предложить, что эти изменения наступают вследствие уменьшения концентрации минеральных компонентов. Таким образом, приведённые данные дают основания проводить различные исследования по метаболизму углерода у водородных бактерий в зависимости от физиологического состояния клеток и условий эксперимента. Для получения более полной картины процесса фиксации двуокиси углерода растущей популяцией Z=1 дальнейшие исследования проводили на интактной культуре. Продолжительность опытов достигала нескольких десятков часов. На рисунке 5 показаны изменение сухого веса биомассы и общего расхода СО2 на 1 мл. суспензии бактерий Z=1 дальнейшие исследования проводили на интактной культуре. Продолжительность опытов достигала нескольких десятков часов. На рисунке 5 показаны изменение сухого веса биомассы и общего расхода СО2 на 1 мл. суспензии бактерий Z=1. Из этих данных видно, что потребление СО2 клетками Z=1 пропорционально увеличению биомассы. И это вполне очевидно. В опытах по изучению интенсивности процесса фиксации СО2 бактериями Z-1 по фазам роста была вскрыта интересная закономерность. Было установлено, что наиболее интенсивное включение СО2 происходит в лаг и начале логарифмической фазах роста бактерий. По мере перехода популяции в стационарную фазу роста интенсивность включения СО2. снижается (рис.6). Аналогичная закономерность в синтезе основных клеточных компонентов для данной культуры была показана ВЕДЕНИНОЙ (1968). Интенсивное включение СО2 бактериями Z-1 в указанных фазах роста,следовательно, связано с усиленным синтезом белков, нуклеиновых кислот и, в меньшей степени, других веществ. Увеличение содержания этих компонентов происходит, вероятно, за счёт ферментных систем, обеспечивающих синтез энергии и восстановление углекислоты. Исследование влияния кислорода на рост Z-1, окисление водорода и фиксацию СО2 показали, что все эти процессы полностью затормаживаются когда и клетки находятся в состоянии анаэробиоза. Добавление кислорода возобновляет указанные процессы. Увеличение О2 до 30% также останавливает рост и фиксацию СО2 показали, что все эти процессы полностью затормаживаются когда клетки находятся в состоянии анаэробиоза. Добавление кислорода возобновляет указанные процессы. Увеличение О2 до 30% также останавливает рост и фиксацию СО2 показали, что все эти процессы полностью затормаживаются когда клетки находятся в состоянии анаэробиоза. Добавление кислорода возобновляет указанные процессы. Увеличение О2 до 30% также останавливает рост и фиксацию СО2. На рис.7 приведена типичная картина изменений роста и потребление СО2 бактериями Z-1 под влиянием кислорода. После подачи 40 мл СО2 и 20мл кислорода в реактор поступал только водород. По мере потребления кислорода (эти данные на рисунке не показаны) наступало замедление роста и потребления СО2 (участок АВ). Полное исчерпание О2 прекращало рост и фиксацию (Участок ВС). Последующее добавление СО2 вызывало только снижение рН без дальнейшего повышения. Добавление же кислорода немедленно стимулировало рост биомассы и потребление СО2 вызывало только снижение рН без дальнейшего его повышения. Добавление же кислорода немедленно стимулировало рост биомассы и потребление СО2 (участок СД). Аналогичная картина наблюдалась и при снижении высоких парциальных давлений О2 (>25%) до оптимальных. (<22%, =22%). Приведённые выше данные указывают на прямую зависимость процесса фиксации углекислоты у водородных бактерий от реакций синтеза бактерий от реакций синтеза энергии, в которых конечным акцептором электронов служит кислород. Последний, вероятно, может влиять на процесс фиксации СО2 следующим образом: при снижении парциального давления кислорода до нуля происходит полное восстановление компонентов дыхательной цепи. Вследствие этого окисление водорода, перенос электронов по дыхательной цепи и синтез богатых энергией соединений прекращаются, что, в свою очередь, приводит к прекращению фиксации СО2. В случае высоких парциальных давлений кислорода, вероятно, возникает холостое окисление водорода. При этом через некоторое время наступает полное истощение ранее синтезируемой энергии и превращении фиксации СО2.
Рис.5. Потребление СО2 (1) растущими плетками Н.Z-1 и изменение биомассы (2). Бактерии выращивались на среде №3. Остальные условия те же, что и на рисунке 1.
Рис 3.
Рис.7
Рисунок 1 Рисунок 2
Рисунок 5. Расход СО2 (х-х) на единицу биомассы Hydrogenononas Z-1 в давлении массы от фазы роста культуры. кривая роста.
Рисунок 6 Ингибирование и стимуляции потребления СО2 и роста Hydrogenononas Z-1 кислородом (пояснение в тексте). кривая роста, изменения рН.
Рисунок 6. Расход СО2 (х-х) на единицу биомассы в зависимости от фазы роста бактерий Н. Z-1. изменения сухого веса биомассы. Условия те же, что и на рисунке 3.
Подписи к рисункам.
Рисунок 1. Изменения РН сред №1 (1) и №2 (2) при продувании их смесью составом: 80 % Н2+10% О2+10%СО2. Стрелками показаны начала продувания. Рисунок 2. Изменения рН (1) и оптимистической плотности суспензии растущих клеток Hydrogenomonas Z=1 (2). Стрелками показаны моменты добавления СО2 в реактор (мл): 1-80, 2-50. Среда №1, Т=30 градусов, объём реактор (мл): 1-80, 2-50. Среда №1, Т=30 градусов, объём жидкой фазы реактора-0,5 л., газовой- 0,7 л. Число оборотов магнитной мешалки-1200 об\минуты. Рисунок 3. Изменения рН(1) и оптической плотности суспензии растущих клеток Hydrogenomonas Z=1 (2). Стрелками показаны моменты добавления СО2 в реактор (мл): 1-44, 2-54, и 3-84. Среда №2. Остальные условия те же, что на рисунке 2. Обозначения смотрите на рисунке 2. Рисунок 4. Изменения рН (1) и оптической плотности суспензии растущих клеток Hydrogenomonas Z=1(2) стрелками показаны моменты добавления СО2 в реактор (мл): 1-44, 2-54, и 3-84. Среда №2. Остальные условия те же, что и на рисунке 2. Обозначения смотрите на рисунке 2. Рисунок 4. Изменения рН(1) и оптической плотности суспензии растущих клеток Hydrogenomonas Z=1(2) Стрелками показаны моменты добавления газов: 1-80 мл СО2; 2-55 мл СО2; 3-76 мл. СО2; 4- 10%СО2+10%О2+80%Н2. Среда№2. Остальные обозначения смотрите на рисунке 2. Рисунок 5. Изменения общего расхода СО2 (1_ и сухого веса биомассы растущей популяции Hydrogenomonas Z=1 (2) стрелками показаны моменты добавления газов: 1-80 мл СО2; 2-55 мл СО2; 3-76 мл СО2; 4-10%СО2 +10%О2+80%Н2. Среда №2. Остальные обозначения смотрите на рисунке 2. Рисунок 5. Изменения общего расхода СО2(1) и сухого веса биомассы растущей популяции Hydrogenomonas Z=1 (2). Среда № 3. Остальные обозначения смотрите на рисунке 2. Рисунок 6. Расход СО2 на единицу сухого веса биомассы (1) в зависимости от фазы роста Hydrogenomonas Z=1 (2). Среда № 3. Остальные условия те же, что и на рисунке 2. Рисунок 6. Расход СО2 на единицу сухого веса биомассы (1) в зависимости от фазы роста Hydrogenomonas Z=1 2-изменения сухого веса биомассы. Условия те же, что и на рисунке 5. Обозначения смотрите на рисунке 2.
Всесоюзный Научно-исследовательский биотехнический институт автор: Золотухин Н.В.
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты
Изобретение относится к технической микробиологии и способу получения биомассы микроорганизмов с максимальным использованием компонентов питательной среды. Известен способ получения биомассы, например, водородокисляющих микроорганизмов в непрерывной культуре, по которому культурная жидкость не возвращается, а скорость протока регулируются скоростные подачи в реактор питательной среды при помощи насоса. Кроме того, по данному способу осуществляется регистрация растворенных О2 и СО2, но не Н2 и источника азота. Уровень по данному способу фиксируется жестким трубопроводом, введённым в аппарат снизу на определённую его высоту. / Bonges, Medici, 1968. Bioregenerative systems/ . Недостатками данного способа являются: 1. большой расход минеральных солей на единицу синтезируемой биомассы: 2. Отсутствие датчиков на Н2 и источник азота; отсутствие регулятора, согласующего со скорости выхода биомассы из реактора со скоростью подачи в него питательной среды; 4. невозможность регулирования уровня микробной культуры в реакторе в ходе процесса. Цель настоящего изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов в стерильных условиях с максимальным использованием компонентов питательной среды. Поставленная цель постигается путём выращивания микроорганизмов в замкнутом по газам и жидкости и изолированной от посторонней флоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по туру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов: бактерий подают в реактора через приемник в сепаратор для отделения биомассы от культурной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей. Количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культурной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в аппарате и осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и регулируют уровень микронной суспензии в реакторе высотой столба её на высоте из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода. Предлагаемый способ может осуществлен, например, при помощи системы, представленной на фигуре 1. Бактерии выращиваются в реакторе 1, в который введены датчики величины Н2:О2, концентрации растворенной углекислоты 3 и газообразного аммиака 4 Показания датчиков регистрируются и усиливаются усилителями 5-7 и передаются на контрольно-командное устройство 8, которое регулирует потоки соответствующих газов в зависимости от концентрации их в реакторе и скорости потребления клетками. Газы в реактор проходят через бактериальный фильтр 9, выполненный, например, из ваты. В реакторе газы смешиваются и циркулируют по замкнутому контуру через конденсатор паров воды 10, компрессор 1 фильтр и жидкую фазу реактора. Из реактора бактериальная суспензия через гибкий трубопровод 12 поступает в приёмник 13, газовая фаза которого соединена с газовой фазой реактора для обеспечения возможности выполнения приемника бактериальной культурой. Из приемника бактериальная суспензия, лишенная пузырьков газов, в результате отстоя, направляется в сепаратор 14, из которого биомасса поступает в сушилку или на обработку, а культурная жидкость - в сосуд для обогащения минеральными компонентами 15. В данный сосуд каждый минеральный компонент подается из соответствующего бункера 23 через смеситель 24, бункер 16 при помощи дозатора 17 и дозами, количественно равным содержанию его в биомассе, отдельной при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости. Для более интенсивного растворения солей в сосуде 15, сквозь его жидкую фазу продувается воздух при помощи компрессора 18. После обогащения раствор подаётся через бактериальные фильтры 19 в сосуды 20 под действием вакуума, создаваемого в этих сосудах вакуумными насосами 21. После наполнения сосуда 20 питательной средой открывается сообщение его газовой фазой через фильтр 9 с тем, чтобы среда могла вытекать из сосуда в реактор. На схеме показано два сосуда, один из которых в тот или иной момент времени является рабочим, а другой в это время заполняется обогащённой культурной жидкостью. Регулирование скорости протока по данному способу осуществляется регулированием потока среды, входящей в реактор из сосудов 20, при помощи датчика концентрации биомассы 22 на выходе её из реактора и системы, регулирующей поток питательной среды в реактор, например, путём изменения сечения трубопровода, по которому среда поступает в реактор. Уровень культуры в реакторе поддерживается и регулируется путём сохранения или изменения положения гибкого трубопровода 12 в вертикальной плоскости, который вместе с реактором составляет систему сообщающихся сосудов. Перед началом процесса стерилизации подвергается: реактор; сосуды для сбора обогащённой культурной жидкости; трубопроводы, по которым жидкая среда поступает в реактор и магистрали для газов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде, например, водородокисляющих микроорганизмов, в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса отличающийся тем, что с целью максимального использования компонентов питательной среды, выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и под бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от културальной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации в реакторе осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе ей из реактора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор, и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба ей на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода. Автор: Заместитель директора по науке . \К.М.Богданов\
"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель директора по науке ВНИИбиотехника
_______________\К.М.БОГДАНОВ\
"___" _______ 1971г.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О полезности предполагаемого изобретения "Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты".
1. На заключение представлен способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, по которому выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры к системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепоральные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерии минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в реакторе регулируют потоком среды, входящую в реактор нептора и системы, меняющей поток минеральной среды, входящую в реактор нептора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор, и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба ей на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
2. Прототипом данного способа является способ, по которому выращивание микроорганизмов производят в непрерывной культуре с подачей питательной среды при помощи насоса, регистрируют концентрации растворённых О2 и СО2 при помощи датчиков, а уровень культуры в реакторе поддерживают при помощи жёсткого трубопровода, введённого снизу в реактор на соответствующую его высоту.
3. Общими признаками предлагаемого способа и прототипа являются непрерывность процесса и контроль концентрации О2 и СО2 , а также поддержание постоянного уровня бактериальной суспензии в реакторе.
4. Предлагаемый способ проходит испытания \ лабораторные + в институте\ и даёт положительные результаты.
5. Предлагаемый способ полезен и нов. В данном способе найдены условия максимального превращения компонентов среды в биомассу, решена задача регулирования уровня микробной суспензии в реакторе в ходе процесса и обеспечивается стерильный возврат в реактор культуральной жидкости без её предварительного нагрева.
6. В связи с большим интересом, проявляемым зарубежными фирмами \США, ФРГ, Канады, Англии, ГДР, Японии и других\ к работам автора в данном направлении, считаем целесообразным патентование данного изобретения в США, Японии, ФРГ, Канаде, Англии, Франции, Италии, Дании, Венгрии.
Заведующий лабораторией физико-химического анализа \ Р.М. Терникова\
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
Автор: Золотухин Н.В.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ГАЗООБРАЗНЫЕ СУБСТРАТЫ.
Изобретение относится к технической микробиологии и способу получения биомассы микроорганизмов с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Известен способ получения биомассы, например, водородо окисляющих микроорганизмов в непрерывной культуре, по которому культурная жидкость не возвращается, а скорость протока регулируется скоростью подачи в реактор питательной среды при помощи насоса. Кроме того, по данному способу осуществляется регистрация растворенных О2 и СО2 , но не Н2 и источника азота. Уровень по данному способу фиксируется жёстким трубопроводом, введённым в аппарат снизу на определённую его высоту \ Bongers, Medici, 1968. Bioregenerative systems\
Недостатками данного способа являются: 1. большой раскол минеральных солей на единицу синтезируемой биомассы; 2. Отсутствие датчиков на Н2 и источники азота; отсутствие регулятора, согласующегося скорости выхода биомассы из реактора со скоростью подачи в него питательной среды; 4. невозможность регулирования уровня микробной культуры в реакторе в ходе процесса. Цель настоящего изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов в стерильных условиях с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Поставленная цель достигается путём выращивания микроорганизмов в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в аппарате осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Предлагаемый способ может быть осуществлён, например, при помощи системы, представленной на фигуре 1. Бактерии выращиваются в реакторе 1, в которые введены датчики величины Н2:О2 2, концентрации растворённой углекислоты 3 и газообразного аммиака 4. Показания датчиков регистрируются и усиливаются усилителями 5-7 и передаются на контрольно-командное устройство 8, которое регулирует потоки соответствующих газов в зависимости от концентрации их в реакторе и скорости потребления клетками. Газы в реактор проходят через бактериальный фильтр 9, выполненный, например, из ваты. В реакторе газы смешиваются и циркулируют по замкнутому контуру через конденсатор паров воды 10, компрессор 11 фильтр и жидкую фазу реактора.
Из реактора бактериальная суспензия через гибкий трубопровод 12 поступает в приёмник 13, газовая фаза которого соединена с газовой фазой реактора для обеспечения возможности наполнения приёмника бактериальной культурой. Из приемника бактериальная суспензия, лишёная пузырьков газов, в результате отстоя, направляется в сепаратор 14, из которого биомасса поступает в сушилку или на обработку, а культуральная жидкость - в сосуд для обогащения минеральными компонентами 15. В данный сосуд каждый минеральный компонент подаётся из соответствующего бункера 23 через смеситель 24, бункер 16 при помощи дозатора 17 и дозами, количественно равными содержанию его в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости. Для более интенсивного растворения солей в сосуде 15, сквозь его жидкую фазу продувается воздух при помощи компрессора 18. После обогащения раствор подаётся через бактериальные фильтры 19 в сосуды 20 под действием вакуума, создаваемого в этих сосудах вакуумными насосами 21. После наполнения сосуда 20 питательной средой открывается сообщение его газовод фазой через фильтр 9 с тем, чтобы среда могла вытекать из сосуда в реактор. На схеме показано два сосуда, один из которых в тот или иной момент времени является рабочим, а другой в это время заполняется обогащённой культуральной жидкостью.
Регулирование скорости протока по данному способу осуществляется регулированием потока среды, входящей в реактор из сосудов 20, при помощи датчика концентрации биомассы 22 на выходе её из реактора и системы, регулирующей поток питательной среды в реактор, например, путём изменения сечения трубопровода, по которому среда поступает в реактор.
Уровень культуры в реакторе поддерживается и регулируется путём сохранения или изменения положения гибкого трубопровода 12 в вертикальной плоскости, который вместе с реактором составляет систему сообщающихся сосудов.
Перед началом процесса стерилизации подвергаются: реактор; сосуды для сбора обогащённой культуральной жидкости; трубопроводы, по которым жидкая среда поступает в реактор и магистрали для газов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде, например, водородокисляющих микроорганизмов, в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, отличающихся там, что с целью максимального использования компонентов питательной среды, выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации в реакторе осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор, и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора выполненном в виде гибкого трубопровода.
Автор: Заместитель директора по науке \К.М. Богданов\
"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель директора по науке ВНИИбиотехника
__________________________ \К.М. Богданов\
"____" ____________________ 1971г.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О полезности предполагаемого изобретения "Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстракты".
1. На заключение представлен способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, по которому выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактерии минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в реакторе регулируют потоком среды, входящую в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор, и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
2. Прототипом данного способа является способ, по которому выращивание микроорганизмов производят в непрерывной культуре с подачей питательной среды при помощи насоса, регистрируют концентрации растворённых О2 и СО2 при помощи датчиков, а уровень культуры в реакторе поддерживают при помощи жёсткого трубопровода, введённого снизу в реактор на соответствующую его высоту.
3. Общими признаками предлагаемого способа и прототипа являются непрерывность процесса и контроль концентрации О2 и СО2 , а также поддержание постоянного уровня бактериальной суспензии в реакторе.
4. Предлагаемый способ проходит испытания \ лабораторные + в институте\ и даёт положительные результаты.
5. Предлагаемый способ полезен и нов. В данном способе найдены условия максимального превращения компонентов среды в биомассу, решена задача регулирования уровня микробной суспензии в реакторе в ходе процесса и обеспечивается стерильный возврат в реактор культуральной жидкости без её предварительного нагрева.
6. В связи с большим интересом, проявляемым зарубежными фирмами \США, ФРГ, Канады, Англии, ГДР, Японии и других\ к работам автора в данном направлении, считаем целесообразным патентование данного изобретения в США, Японии, ФРГ, Канаде, Англии, Франции, Италии, Дании и Венгрии.
Заведующий лабораторией физико-химического анализа \Р.М. Терникова\
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ.
Автор: Золотухин Н.В.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ,
ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ГАЗООБРАЗНЫЕ СУБСТРАТЫ
Изобретение относится к технической микробиологии и способу получения биомассы микроорганизмов с максимальным и использованием компонентов питательной среды.
Известен способ получения биомассы, например, водородокисляющих микроорганизмов в непрерывной культуре, по которому культурная жидкость не возвращается, а скорость протока регулируется скоростью подачи в реактор питательной среды при помощи насоса. Кроме того, по данному способу осуществляется регистрация растворённых О2 и СО2, но не Н2 и источника азота. Уровень по данному способу фиксируется жёстким трубопроводом, введённым в аппарат снизу на определённую его высоту \Bongers, Medici, 1968. Bioregenerative systems\
Недостатками данного способа являются: 1. большой расход минеральных солей на единицу синтезируемой биомассы; 2. отсутствие скорости выхода биомассы из реактора со скоростью подачи в него питательной среды; 3. невозможность регулирования уровня микробной культуры в реакторе в ходе процесса.
Цель настоящего изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов в стерильных условиях с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Поставленная цель достигается путём выращивания микроорганизмов в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от посторонней флоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по туру газового питания с регистрацией и поддерживанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов: бактериальную суспензию ректора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в аппарате осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Предлагаемый способ может быть осуществлён, например, при помощи системы, представленной на фигуре 1. Бактерии выращиваются в реакторе 1, в который введены датчики величины Н2:О2 2, концентрации растворённой углекислоты 3 и газообразного аммиака 4. Показания датчиков регистрируются и усиливаются усилителями 5-7 и передаются на контрольно-командное устройство 8, которое регулирует потоки соответствующих газов в зависимости от концентрации их в реакторе и скорости потребления клетками. Газы в реактор проходят через бактериальный фильтр 9, выполненный, например из ваты. В реакторе газы смешиваются и циркулируют по замкнутому контуру через конденсатор паров воды 10, компрессор 11 фильтр и жидкую фазу реактора.
Из реактора бактериальная суспензия через гибкий трубопровод 12 поступает в приёмник 13, газовая фаза которого соединена с газовой фазой реактора для обеспечения возможности наполнения приёмника бактериальной культурой. Из приёмника бактериальная суспензия, лишённая пузырьков газов, в результате отстоя, направляется в сепаратор 14, из которого биомасса поступает в сушилку или на обработку, а культуральная жидкость - в сосуд для обогащения минеральными компонентами 15. В данный сосуд каждый минеральный компонент подаётся из соответствующего бункера 23 через смеситель 24, бункер 16 при помощи дозатора 17 и дозами, количественно равным содержанию его в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости. Для более интенсивного растворения солей в сосуде 15, сквозь его жидкую фазу продувается воздух при помощи компрессора 18. После обогащения раствор подаётся через бактериальные фильтры 19 в сосуды 20 под действием вакуума, создаваемого в этих сосудах вакуумными насосами 21. После наполнения сосуда 20 питательной средой открывается сообщение его газовой фазой через фильтр 9 с тем, чтобы среда могла вытекать в тот или иной момент времени является рабочим, а другой в это время заполняется обогащённой культуральной жидкостью.
Регулирование скорости протока по данному способу осуществляется регулированием потока среды, входящей в реактор из сосудов 20, при помощи датчика концентрации биомассы 22 на выходе её из реактора и системы, регулирующей поток питательной среды в реактор, например, путём изменения сечения трубопровода, по которому среда поступает в реактор.
Уровень культуры в реакторе поддерживается и регулируется путём сохранения или изменения положения гибкого трубопровода 12 в вертикальной плоскости, который вместе с реактором составляет систему сообщающихся сосудов.
Перед началом процесса стерилизации подвергаются: реактор; сосуды для сбора обогащённой культуральной жидкости; трубопроводы, по которым жидкая среда поступает в реактор и магистрали для газов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде, например, водородокисляющих микроорганизмов, в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, отличающийся тем, что с целью максимального использования компонентов питательной среды, выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержинием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости, и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации в реакторе осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор, и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора выполненном в виде гибкого трубопровода.
Автор: Заместитель директора по науке \К.М. Богданов\
"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель директора по науке ВНИИбиотехника
__________________________ \К.М. Богданов\
"____" ____________________ 1971г.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О полезности предполагаемого изобретения "Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты".
1. На заключение представлен способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, по которому выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через прикости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактерии минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в реакторе регулируют потоком среды, входящую в реактор нептора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
2. Прототипом данного способа является способ, по которому выращивание микроорганизмов производят в непрерывной культуре с подачей питательной среды при помощи насоса, регистрируют концентрации растворённых О2 и СО2 при помощи датчиков, а уровень культуры в реакторе поддерживают при помощи жесткого трубопровода, введённого снизу в реакторе поддерживают при помощи жёсткого трубопровода, введённого снизу в реактор на соответствующую его высоту.
3. Общими признаками предлагаемого способа и прототипа являются непрерывность процесса и контроль концентрации О2 и СО2, а также поддержание постоянного уровня бактериальной суспензии в реакторе.
4. Предлагаемый способ проходит испытания \лабораторные+ в институте\ и даёт положительные результаты.
5. Предлагаемый способ полезен и нов. В данном способе найдены условия максимального превращения компонентов среды в биомассу, решена задача регулирования уровня микробной суспензии в реакторе в ходе процесса и обеспечивается стерильный возврат в реактор культуральной жидкости без её предварительного нагрева.
6. В связи с большим интересом, проявляемым зарубежными фирмами \США, ФРГ, Канады, Англии, ГДР, Японии и других\ к работам автора в данном направлении, считаем целесообразным патентование данного изобретения в США, ФРГ, Канады, Англии, Франции, Италии, Дании и Венгрии.
Заведующая лабораторией физико-химического анализа \Р.М. Терникова\
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
Автор: Золотухин Н.В.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ГАЗООБРАЗНЫЕ СУБСТРАТЫ
Изобретение относится к технической микробиологии к способу получения биомассы микроорганизмов с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Известен способ получения биомассы, например, водородокисляющих микроорганизмов в непрерывной культуре, по которому культурная жидкость не возвращается, а скорость протока регулируется скоростью подачи в реактор питательной среды при помощи насоса. Кроме того, по данному способу осуществляется регистрация растворённых О2 и СО2,но не Н2 и источника азота. Уровень по данному способу фиксируется жестким трубопроводом, введённым в аппарат снизу на определённую его высоту \Bongers, Medici, 1968. Bioregenerative systems\.
Недостатками данного способа являются: 1. большой расход датчиков на Н2 и источник азота; отсутствие регулятора, согласующего скорости выхода биомассы из реактора со скоростью подачи в него питательной среды; 2. невозможность регулирования уровня микробной культуры в реакторе в ходе процесса.
Цель настоящего изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов в стерильных условиях с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Поставленная цель достигается путём выращивания микроорганизмов в замкнутой по фазам и жидкости и изолированной от посторонней флоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси туру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в аппарате осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Предлагаемый способ может быть осуществлён, например, при помощи системы, представленной на фигуре 1. Бактерии выращиваются в реакторе 1, в который введены датчики величины Н2:О2 2, концентрации растворенной углекислоты 3 и газообразного аммиака 4. Показания датчиков регистрируются и усиливаются усилителями 5-7 и передаются на контрольно-командное устройство 8, которое регулирует потоки соответствующих газов в зависимости от концентрации их в реакторе и скорости потребления клетками. Газы в реактор проходят через бактериальный фильтр 9, выполненный, например, из ваты. В реакторе газы смешиваются и циркулируют по замкнутому контуру через конденсатор паров воды 10, компрессор 11, фильтр и жидкую фазу реактора.
Из реактора бактериальная суспензия через гибкий трубопровод 12 поступает в приемник 13, газовая фаза которого соединена с газовой фазой реактора для обеспечения возможности наполнения приёмника бактериальной культурой. Из приёмника бактериальная суспензия, лишённая пузырьков газов, в результате отстоя, направляется в сепаратор 14, из которого биомасса поступает в сушилку или на обработку, а культуральная жидкость - в сосуд для обогащения минеральными компонентами 15. В данный сосуд каждый минеральный компонент подаётся из соответствующего бункера 23 через смеситель 24, бункер 16 при помощи дозатора 17 и дозами, количественно равным содержанию его в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости. Для более интенсивного растворения солей в сосуде 15, сквозь его жидкую фазу продувается воздух при помощи компрессора 18. После обогащения раствор подаётся через бактериальные фильтры 19 в сосуды 20 под действием вакуума, создаваемого в этих сосудах вакуумными насосами 21. После наполнения сосуда 20 питательной средой открывается сообщение его газовод фазой через фильтр 9 с тем, чтобы среда могла вытекать из сосуда в реактор. На схеме показано два сосуда, один из которых в тот или иной момент времени является рабочим, а другой в это время заполняется обогащённой культуральной жидкостью.
Регулирование скорости протока по данному способу осуществляется регулированием потока среды, входящей в реактор из сосудов 20, при помощи датчика концентрации биомассы 22 на выходе её из реактора и системы, регулирующей поток питательной среды в реактор, например, путём изменения сечения трубопровода, по которому среда поступает в реактор.
Уровень культуры в реакторе поддерживается и регулируется путём сохранения или изменения положения гибкого трубопровода 12 в вертикальной плоскости, который вместе с реактором составляет систему сообщающихся сосудов.
Перед началом процесса стерилизации подвергаются: реактор; сосуды для сбора обогащённой культуральной жидкости; трубопроводы, по которым жидкая среда поступает в реактор и магистрали для газов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде, например, водородокисляющих микроорганизмов, в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, отличающийся тем, что с целью максимального использования компонентов питательной среды, выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации в реакторе осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Автор: Заместитель директора по науке \К.М. Богданов\
"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель директора по науке ВНИИбиотехника
__________________________ \К.М. Богданов\
"____" ____________________ 1971г.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О полезности предполагаемого изобретения "Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты".
1. На заключение представлен способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, по которому выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культурной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе рано количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерии минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в реакторе регулируют потоком среды, входящую в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
2. Прототипом данного способа является способ, по которому выращивание микроорганизмов производят в непрерывной культуре с подачей питательной среды при помощи насоса, регистрируют концентрации растворённых О2 и СО2 при помощи датчиков, а уровень культуры в реакторе поддерживают при помощи жёсткого трубопровода, введённого снизу в реактор на соответствующую его высоту.
3. Общими признаками предлагаемого способа и прототипа являются непрерывность процесса и контроль концентрации О2 и СО2, а также поддержание постоянного уровня бактериальной суспензии в реакторе.
4. Предлагаемый способ проходит испытания \ лабораторные + в институте\ и даёт положительные результаты.
5. Предлагаемый способ полезен и нов. В данном способе найдены условия максимального превращения компонентов среды в биомассу, решена задача регулирования уровня микробной суспензии в реакторе в ходе процесса и обеспечивается стерильный возврат в реактор культуральной жидкости без её предварительного нагрева.
6. В связи с большим интересом, проявляемым зарубежными фирмами \США, ФРГ, Канады, Англии, Франции, Италии, Дании и Венгрии.
Заведующая лабораторией физико-химического анализа \Р.М. Терникова\
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
Автор: Золотухин Н.В.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ГАЗООБРАЗНЫЕ СУБСТРАТЫ
Изобретение относится к технической микробиологии, к способу получения биомассы микроорганизмов с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Известен способ получения биомассы, например, водородокисляющих микроорганизмов с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Известен способ получения биомассы, например, водородокисляющих микроорганизмов в непрерывной культуре, по которому культуральная жидкость не возвращается, а скорость протока регулируется скоростью подачи в реактор питательной среды при помощи насоса. Кроме того, по данному способу осуществляется регистрация растворенных О2 и СО2, но не Н2 и источника азота. Уровень по данному способу фиксируется жёстким трубопроводом, введённым в аппарат снизу на определённую его высоту \Bongers, medici, 1968. Bioregenerative systems\.
Недостатками данного способа являются: 1. большой расход минеральных солей на единицу синтезируемой биомассы; 2. отсутствие датчиков на Н2 и источник азота; отсутствие регулятора, согласующего скорости выхода биомассы из реактора со скоростью подачи в него питательной среды; 3. невозможность регулирования уровня микробной культуры в реакторе в ходе процесса.
Цель настоящего изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов в стерильных условиях с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Поставленная цель достигается путём выращивания микроорганизмов в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от посторонней флоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по туру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов, бактериальную суспензию реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в аппарате осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполеном в виде гибкого трубопровода.
Предлагаемый способ может быть осуществлён, например, при помощи системы, представленной на фигуре 1. Бактерии выращиваются в реакторе 1, в который введены датчики величины Н2:О2 2, концентрации растворённой углекислоты 3 и газообразного аммиака 4. Показания датчиков регистрируются и усиливаются усилителями 5-7 и передаются на контрольно-командное устройство 8, которое регулирует потоки соответствующих газов в зависимости от концентрации их в реакторе и скорости потребления клетками. Газы в реактор проходят через бактериальный фильтр 9, выполненный, например, из ваты. В реакторе газы смешиваются и циркулируют по замкнутому контуру через конденсатор паров воды 10, компрессор 11, фильтр и жидкую фазу реактора.
Из реактора бактериальная суспензия через гибкий трубопровод 12 поступает в приёмник 13, газовая фаза которого соединена с газовой фазой реактора для обеспечения возможности наполнения приёмника бактериальной культурой. Из приёмника бактериальная суспензия, лишённая пузырьков газов, в результате отстоя, направляется в сепаратор 14, из которого биомасса поступает в сушилку или на обработку, а культуральная жидкость - в сосуд для обогащения минеральными компонентами 15. В данный сосуд каждый минеральный компонент подаётся из соответствующего бункера 23 через смеситель 24, бункер 16 при помощи дозатора 17 и дозами, количественно равным содержанию его в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости. Для более интенсивного растворения солей в сосуде 15, сквозь его жидкую фазу продувается воздух при помощи компрессора 18. После обогащения раствор подаётся через бактериальные фильтры 19 в сосуды 20 под действием вакуума, создаваемого в этих сосудах вакуумными насосами 21. После наполнения сосуда 20 питательной средой открывается сообщение его газовой фазой через фильтр 9 с тем, чтобы среда могла вытекать из сосуда в реактор. На схеме показано два сосуда, один из которых в тот или иной момент времени является рабочим, а другой в это время заполняется обогащённой культуральной жидкостью.
Регулирование скорости протока по данному способу осуществляется регулированием потока среды, входящей в реактор из сосудов 20, при помощи датчика концентрации биомассы 22 на выходе её из реактора и системы, регулирующей поток питательной среды в реактор, например, путём изменения сечения трубопровода, по которому среда поступает в реактор.
Уровень культуры в реакторе поддерживается и регулируется путём сохранения или изменения положения гибкого трубопровода 12 в вертикальной плоскости, который вместе с реактором составляет систему сообщающихся сосудов.
Перед началом процесса стерилизации подвергаются: реактор; сосуды для сбора обогащённой культуральной жидкости; трубопроводы, по которым жидкая среда поступает в реактор и магистрали для газов.
формула изобретения
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, из минеральной среды, например, водородокисляющих микроорганизмов, в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, отличающийся тем, что с целью максимального использования компонентов питательной среды, выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Автор: Заместитель директора по науке \К.М.Богданов\
"УТВЕРЖДАЮ"
Заместитель директора по науке ВНИИбиотехника
__________________________ \К.М. Богданов\
"____" ____________________ 1971г.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
О полезности предполагаемого изобретения "Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты".
1. На заключение представлен способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, на минеральной среде в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, по которому выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерии минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в реакторе регулируют потоком среды, входящую в реактор нептора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
2. Прототипом данного способа является способ, по которому выращивание микроорганизмов производят в непрерывной культуре с подачей питательной среды при помощи насоса, регистрируют концентрации растворённых О2 и СО2 при помощи датчиков, а уровень культуры в реакторе поддерживают при помощи жёсткого трубопровода, введённого снизу в реактор на соответствующую его высоту.
3. Общими признаками предлагаемого способа и прототипа являются непрерывность процесса и контроль концентрации О2 и СО2, а также поддержание постоянного уровня бактериальной суспензии в реакторе.
4. Предлагаемый способ проходит испытания \лабораторные + в институте\ и даёт положительные результаты.
5. Предлагаемый способ полезен и нов. В данном способе найдены условия максимального превращения компонентов среды в биомассу, решена задача регулирования уровня микробной суспензии в реакторе в ходе процесса и обеспечивается стерильный возврат в реактор культуральной жидкости без её предварительного нагрева.
6. В связи с большим интересом, проявляемым зарубежными фирмами \США, ФРГ, Канады, Англии, Франции, Италии, Дании и Венгрии.
Заведующая лабораторией физико-химического анализа \Р.М. Терникова\
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
Автор: Золотухин Н.В.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ГАЗООБРАЗНЫЕ СУБСТРАТЫ
Изобретение относится к технической микробиологии, к способу получения биомассы микроорганизмов с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Известен способ получения биомассы, например, водородокисляющих микроорганизмов в непрерывной культуре, по которому культуральная жидкость не возвращается, а скорость протока регулируется скоростью подачи в реактор питательной среды при помощи насоса. Кроме того, по данному способу осуществляется регистрация растворённых О2 и СО2, но не Н2 и источника азота. Уровень по данному способу фиксируется жёстким трубопроводом, введённым в аппарат снизу на определённую его высоту \Bongers, medici, 1968. Bioregenerative systems\.
Недостатками данного способа являются: 1. большой расход минеральных солей на единицу синтезируемой биомассы; 2. отсутствие датчиков на Н2 и источник азота; отсутствие регулятора, согласующего скорости выхода биомассы из реактора со скоростью подачи в него питательной среды; 3. невозможность регулирования уровня микробной культуры в реакторе в ходе процесса.
Цель настоящего изобретения - разработка способа получения биомассы микроорганизмов в стерильных условиях с максимальным использованием компонентов питательной среды.
Поставленная цель достигается путём выращивания микроорганизмов в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от посторонней флоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по туру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов, бактериальную суспензию реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации биомассы в аппарате осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Предлагаемый способ может быть осуществлён, например, при помощи системы, представленной на фигуре 1. Бактерии выращиваются в реакторе 1, в который введены датчики величины Н2:О2 2, концентрации растворённой углекислоты 3 и газообразного аммиака 4. Показания датчиков регистрируются и усиливаются усилителями 5-7 и передаются на контрольно-командное устройство 8, которое регулирует потоки соответствующих газов в зависимости от концентрации их в реакторе и скорости потребления клетками. Газы в реактор проходят через бактериальный фильтр 9, выполненный, например, из ваты. В реакторе газы смешиваются и циркулируют по замкнутому контуру через конденсатор паров воды 10, компрессор 11, фильтр и жидкую фазу реактора.
Из реактора бактериальная суспензия через гибкий трубопровод 12 поступает в приёмник 13, газовая фаза которого соединена с газовой фазой реактора для обеспечения возможности наполнения приёмника бактериальной культурой. Из приёмника бактериальная суспензия, лишённая пузырьков газов, в результате отстоя, направляется в сепаратор 14, из которого биомасса поступает в сушилку или на обработку, а культуральная жидкость - в сосуд для обогащения минеральными компонентами 15. В данный сосуд каждый минеральный компонент подаётся из соответствующего бункера 23 через смеситель 24, бункер 16 при помощи дозатора 17 и дозами, количественно равным содержанию его в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости. Для более интенсивного растворения солей в сосуде 15, сквозь его жидкую фазу продувается воздух при помощи компрессора 18. После обогащения раствор подаётся через бактериальные фильтры 19 в сосуды 20 под действием вакуума, создаваемого в этих сосудах вакуумными насосами 21. После наполнения сосуда 20 питательной средой открывается сообщение его газовой фазой через фильтр 9 с тем, чтобы среда могла вытекать из сосуда в реактор. На схеме показано два сосуда, один из которых в тот или иной момент времени является рабочим, а другой в это время заполняется обогащённой культуральной жидкостью.
Регулирование скорости протока по данному способу осуществляется регулированием потока среды, входящей в реактор из сосудов 20, при помощи датчика концентрации биомассы 22 на выходе её из реактора и системы, регулирующей поток питательной среды в реактор, например, путём изменения сечения трубопровода, по которому среда поступает в реактор.
Уровень культуры в реакторе поддерживается и регулируется путём сохранения или изменения положения гибкого трубопровода 12 в вертикальной плоскости, который вместе с реактором составляет систему сообщающихся сосудов.
Перед началом процесса стерилизации подвергаются: реактор; сосуды для сбора обогащённой культуральной жидкости; трубопроводы, по которым жидкая среда поступает в реактор и магистрали для газов.
формула изобретения
Способ получения биомассы микроорганизмов, использующих газообразные субстраты, из минеральной среды, например, водородокисляющих микроорганизмов, в условиях контролируемого питания и непрерывности процесса, отличающийся тем, что с целью максимального использования компонентов питательной среды, выращивание микроорганизмов производят в замкнутой по газам и жидкости и изолированной от проникновения посторонней микрофлоры системе, при этом осуществляют циркуляцию газовой смеси по контуру газового питания с регистрацией и поддержанием оптимальной концентрации каждого из газовых компонентов; бактериальную суспензию из реактора через приёмник подают в сепаратор для отделения биомассы от культуральной жидкости, которую затем обогащают дозами смеси солей, количество каждой из которых в дозе равно количеству её в биомассе, отделённой при сепарировании обогащаемого объёма культуральной жидкости и через бактериальные фильтры под действием вакуума подают в систему питания бактерий минеральными компонентами, а поддержание постоянства концентрации в реакторе осуществляют регулированием потока среды, входящей в реактор непрерывно, при помощи датчика концентрации биомассы на выходе её из реактора и системы, меняющей поток минеральной среды, поступающей в реактор и регулируют уровень микробной суспензии в реакторе высотой столба её на выходе из реактора, выполненном в виде гибкого трубопровода.
Автор: Заместитель директора по науке \К.М. Богданов\
ДИНАМИКА РОСТА И ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ, РОСТ ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ИЗМЕНЯЮЩИХСЯ КОНЦЕНТРАЦИЯХ ВОДОРОДА И КИСЛОРОДА.
Водородные бактерии принадлежат к факультативным аэто тропам. В автотрофных условиях эти микроорганизмы окисляют молекулярный водород и используют двуокись углерода в качестве единственного источника углерода. \источниками азота для них служат аммоний, мочевина и нитраты ( Repaske ' 1966, Schlegel, 1966).
Процесс увеличения биомассы водородных бактерий можно представить следующими реакциями:
2Н2 + О2 = 2Н2О + 112 ккал
2Н2 + СО2 = (СН2О) + Н2О
где (СН2О) - условное органическое вещество бактериальной клетки. Реакция (1) является биоэнергетической, а реакция (2) - биосинтетической. Очевидно, что ингибирование одной из них остановит процессы, связанные с увеличением биомассы. Так, например, отсутствие СО2 остановит рост, то есть процессы связанные с увеличением массы углерод содержащих веществ. Реакция (1) при этом будет протекать менее интенсивно. Это есть случай свободного или холостого окисления ( Ruhland, 1922, Schlegel, 1966).
Добавление СО2 усиливает потребление водорода и кислорода в несколько раз (Schlegel, 1966).
Очевидно, что отсутствие СО2 или Н2 полностью остановит обе реакции. Снижение содержания кислорода в реакторе за счёт увеличения водорода индуцирует синтез поли - в - оксимасляной кислоты ( Schuster und Schlegel 1967).
Такое же действие оказывает отсутствие в среде источника азота (Sh(Schlegel e.a., 1961).
Выращивание водородных бактерий в автотрофных условиях проводят на жидкой минеральной среде в сосудах, содержащих Н2О2 и СО2 . Оптимальный состав смеси газов подбирают эмпирически по скорости роста популяции. При этом было установлено, что повышенное содержание кислорода в газовой смеси ингибирует рост. Так, например, бактерии Hydrogenomohas facilis могут расти в атмосфере, содержащей до 30% О2 ( Schatz a. Bovell, 1952), Н. eutropha И Н pantotropha - до 25% О2 (Repaske, 1966) H.flava, H.vitrea И Н ruhladii - до 10% (Repaske, 1966). Водород аналогичного действия не оказывает. Вполне вероятно, что оптимальные соотношения газообразных компонентов для одного и того же вида бактерий могут меняться в зависимости от физиологического состояния клеток, их возраста и других факторов.
Исходя из выше изложенного исследования газового питания водородных бактерий параллельно с биохимическими и другими анализами представляют значительный интерес. Управление этим процессом даёт возможность не только массового выращивания этих бактерий с целью получения полноценных белковых веществ, но и позволит изучить различные процессы в интактных клетках.
Во-первых, источник энергии (Н2) и углерода (СО2) для водородных бактерий являются индивидуальными веществами. Это облегчает решение задачи контроля и регуляции их концентраций в био клеточном пространстве. Осуществление такого контроля даст информацию о направленности и интенсивности био энергетических и биосинтетических процессов в различных состояниях клеточной популяции и условиях эксперимента.
Во-вторых, наличие механизма переключения со свободного на сопряжённое окисление водорода, а также индуцированного синтеза поли-в- оксимасляной кислоты и полифосфатов в условиях котралируемого газового питания позволит выяснить механизмы и биологический смысл этих процессов.
В-третьих, сам факт, что бактерии синтезируют аминокислоты, органический кислоты, ДНК, РНК, белки, липиды, сахара и т.п. из простых газов и незначительного числа минеральных компонентов, представляет огромных интерес для проведения различных исследований возможностей управления газового питания и посвящена настоящая работа.
Разработке методов контроля растворённых Н2,О2 и СО2, исследованию роста и биосинтетической активности водородных бактерий в условиях управляемого газового питания и посвящена настоящая работа.
МАТЕРИАЛЫ
В экспериментах был использован активный штамм Hydrogenomonas Z-1. Выращивание проводили на жидкой минеральной среде содержащей (г\л): NaHPO4 - 9,0; KH4PO4-1,5 ; NH4Cl-1,0; MgSO4-0,2; FeNH4- цитрат - 0,0012; CaCl2 - 0,002; NaHCO3 - 0,5 и микроэлементы Хогланда. Газы в реактор, в котором проводили выращивание бактерий, подавались в смеси или раздельно. Перемешивание культуры осуществили железным сердечником при помощи лабораторной магнитной мешалки. Оптическую плотность бактериальной суспензии измеряли при 436 ммк. Потенциал регистрировали лабораторным потенциометром.
МЕТОД
Так как контроль потребления газов составляет основную трудность в опытах по выращиванию водородных бактерий, нами была поставлена задача разработать простые методы регистрации растворённых газов используемых данными микроорганизмами.
В целях регистрации соотношения Н2\О2 в культуральной жидкости нами был применён платиновый электрод. Как известно присутствие Н2 или О2 в растворе создаёт на платине соответствующие потенциалы. В случае водорода потенциал на платине обусловлен равновесием:
Н2 = 2Н+ + 2е (3)
а в случае кислорода - взаимодействием О2 на поверхности платины с различными примесями, находящимися в растворе:
П+О2 = ОП + nН+ + ne (4)
где П-примеси, ОП-окисление примеси (Скаргеллети,1963; Wroblow a.e. 1967)
Из уравнений (3) и (4) видно, что при одновременном присутствии Н2 и О2 в растворе потенциал платинового электрода будет зависеть от их соотношения. Так, например, увеличение парциального давления водорода ( РН2) за счёт снижения (РО2) сдвинет реакцию (3) вправо, а реакцию (4) - влево. Равновесие, которое установится между реакциями (3) и (4) даст соответствующий потенциал. Повышение РО2 за счёт снижения РН2 сдвинет равновесие и потенциал в обратную сторону.
Применение платинового электрода в качестве непрерывно действующего индикатора соотношением Н2\О2 в бактериальной суспензии дало положительные результаты. При этом электрод показал устойчивую работу и чувствительность при многократных повторных использованиях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Для определения соотношения Н2\О2 в бактериальной суспензии были проведены исследования по установлению зависимости потенциала платинового электрода от состава газовой фазы и концентрации клеток в реакторе. Типичные кривые, полученные в этих опытах, показаны на рис.1. Из этих данных видно, что между потенциалом платинового электрода и соотношением Н2\О2 при постоянной концентрации клеток в среде существует строгая зависимость. Присутствие СО2 практически не меняло данной закономерности. Увеличение концентрации клеток в среде смещает кривую зависимости в область положительных значений потенциала. Эти смещения незначительны и ими можно пренебречь, если процесс ведётся при меняющихся соотношениях Н2\О2, либо учитывать их по калибровочным кривым.
С целью определение оптимальных соотношений Н2\О2 выращивание водородных бактерий проводили в атмосфере, содержащей постоянное количество СО2 и разные количества Н2 и О2 . На рис. 2 показаны кривые роста Н. Z-1 и изменения соотношения Н2\О2 при постоянном поступлении в реактор газовой смеси состава 65% Н2 , 25% О2 и 10% СО2. По достижению соотношения Н2\О2 значения равного 2 наступало торможение роста. Потребление газов при этом не прекращалось. Вероятнее всего, что в данном случае наступало не сопряженное с синтезом энергии окисления водорода. Уменьшение содержания кислорода в реакторе стимулировало рост.
На рис. 3 показаны изменения роста Н. Z=1 и изменения соотношения Н2\О2 при подаче в реактор смеси составом 80-85% Н2, 5-10% О2 и 10% СО2. В этом случае поступало не только торможение роста, но и прекращение потребления газов по достижению соотношения Н2\О2 значения более 30. Это можно объяснить тем, что в исходной смеси кислорода было недостаточно, а скорость поступления его в реактор меньше скорости потребления этого газа бактериями. Увеличение содержания О2 в газовой смеси стимулировало дальнейший рост бактерий.
При раздельной подаче Н2 и О2 в реактор рост Н.Z-1 проходил непрерывно, но менее интенсивно. На рис. 4 показана типичная картина изменений потенциала платинового электрода и роста бактерий в ответ на изменение содержания Н2 и О2 в реакторе. Из этих данных видно, что периодические колебания соотношения Н2\О2 в реакторе не приводят к остановке роста, хотя колебания этой величины проходили в области от 2 до 30 и более. Подобными опытами было установлено, что максимальный рост Н. Z=1 минимальное (время удвоения сухого веса или оптической плотности) проходит при соотношении Н2\О2 равном 3-5. Это соответствует газовой смеси составом 68-75% Н2, 15-22% О2 и 10% СО2.
Таким образом, полученные данные указывают на то, что рост водородных бактерий может проходить при значительных колебаниях содержания кислорода и водорода в культуральной жидкости. Оптимальные количества Н2 и О2 в газовой смеси такие могут меняться, но в узких пределах.
В заключении можно сказать, что применение метода непрерывной индикации соотношения Н2\О2 в культуральной жидкости позволит установить оптимальные значения этих величин для каждого вида водородных бактерий во всех фазах роста. Применение его наряду с методом регистрации СО2 даст возможность подробно изучить рост и биосинтетическую активность данных бактерий в различных режимах поступления газов к клеткам и других условиях.
Автор глубоко признателен Г.А. Заверзину за руководство и ценные советы в микробиологической части настоящей работы. Для определения и регистрации соотношения Н2:О2 в реакторе. Многочисленными опытами было установлено, что платиновый электрод является хорошим индикатором соотношения Н2:О2 , устойчив в работе и сохраняет чувствительность после многократных повторных использованиях.
Автор выражает глубокую благодарность кандидату химических наук О.А. Петри за ценные советы и замечания по методической части работы, а также Н.Д. Савельевой за ценные советы по выращиванию водородо окисляющих бактерий.
ВЫВОДЫ
1. Методом непрерывной индикации соотношения Н2\О2 в развивающейся культуре водородных бактерий показано, что бактерии сохраняют непрерывный рост при периодических Hydrogonomonas Z-1 колебаниях Н2\О2 в области 2-30 и более.
2. Оптимальные значения величины Н2\О2 для Н.Z-1 равны 3-5.
ЛИТЕРАТУРА
Скоргеллети 1963, Теоретическая электрохимия
Packer 1, and Viahniak, 1955, J. Bacteriol. 70, 216
Repasko R., 1966, Biotechnol. Rioeng. 8,217
Ruhland W., 1922, Ber. Deutache Botan. Ges., 40, 180
Schats A. and Bovell C., 1952, J. Bacteriol., 63,87
Schlegel H.G., Gottachalk G. and Ratra R., 1961, Nature, 191, 463
Schlegel H.G., 1966, Advanced Compar. Physiol. a. Biochen., 2, 135
Schuster E. and Schlegel H.G.,1967, 15,139 Arch.Mikrobiol., 58,380
J. Klecnroanal, Chem., 15, 139
Рис. 1. Зависимость потенциала платинового электрода от соотношения Н2\О2 в газовой фазе и концентрации бактериальной суспензии (1- 0,62 г\л; 2- 1,25 г\л и 3 - 2,50 г\л. Газовая фаза - 0,5л; жидкая фаза - 0,7л; Т=200С; число оборотов мешалки - 800 об\мин. Значения потенциала даны относительно водородного электрода.
Рис. 2. Изменения соотношения Н2\О2 (1) и роста бактерий Н.Z=1 (2) в атмосфере составом 65% Н2, 25% О2 и 10% СО2. Газовая фаза - 0,5л; жидкая фаза - 0,7 л, Т= 200 С; число оборотов мешалки - 800 об\мин.
Рис.3. Изменения соотношения Н2\О2 (1) и роста бактерий Н.Z-1 (2) в атмосфере составом 83% Н2, 7% О2 и 10% СО2. Остальные условия те же, что и на рис.2.
Рис. 4. Рост Н. Z-1 (2) и изменения потенциала (1) при периодической подаче водорода и кислорода в реактор. Остальные условия те же, что и на рис.2. Стрелками обозначена газовая смесь (90% Н2 + 10% СО2) мл. Моменты подачи О2, мл: а-15, б-20, в,г-30, д-50, е-30.
К ВОПРОСУ ИССЛЕДОВАНИЯ ХЕМОСИНТЕЗА У ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ
Водородные бактерии играют роль одного из биологических звеньев в круговороте таких газов как Н2, О2, и СО2. Исследование этих бактерий является очень заманчивым и перспективным направлении в решении проблем биоэнергетики и биосинтеза интактных клеток. Кроме того, эти бактерии представляют значительный интерес с точки зрения возможности их применения для синтеза белка из Н2, О2, и СО2.
При исследовании различных сторон метаболизма водородных бактерий возникает ряд методических трудностей. Одной из них является контроль и регуляция поступления газов в реактор с растущей популяцией бактерий. До сих пор в литературе не описано использование простых и надёжных методов контроля потребления газа Н2, О2, и СО2 бактериями и регуляции поступления их в реактор и определения их количественного расхода на единицу биомассы в зависимости от различных факторов. В опубликованных работах приводятся различные методы контроля содержания газов и регуляции их поступления в реактор. Все эти методы основаны на различных принципах анализа газовой фазы реактора, по результатам которых судится о необходимости подачи в реактор смеси того или иного состава.
Общим недостатком этих методов является то, что они не обеспечивают непрерывный контроль содержания Н2, О2, и СО2 в жидкой фазе реактора. Этот недостаток очень существенный при проведении опытов по выяснению соотношений потребляемых газов в зависимости от физиологического состояния клеток, различных условий эксперимента и изучении реакций клеток на кратковременные изменения концентраций растворённых Н2, О2, и СО2.
Регуляция поступления газов в реактор осуществляется, например, программным устройством, которое задаёт такой режим поступления Н2, О2, и СО2, при котором их соотношения близки к установленном Foster and Zichtfield, 1963). Помимо этого описан также метод регуляции содержания водорода и кислорода в реакторе, основанный на том, что в реактор вводятся электроды для электролиза воды. При этом для выделения О2 один электрод находится в реакторе, а другой вне реактора в сосуде со средой, отделённом от реактора полупроницаемой мембраной. Меняя поверхности этих электродов, можно добиться того, что при электролизе воды в реакторе водород и кислород будут выделяться в соотношении большем двух ( Schuster und Schlegel, 1967). В задачу настоящей работы входило создание установки, позволяющей непрерывно регистрировать содержание Н2, О2, и СО2 в жидкой фазе реактора и осуществлять контроль за потреблением каждого газа растущей популяцией водородных бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. В опытах использовали штамм Hydrogenomonas Z-1, выделенный в отделе физиологии хемосинтезирующих микроорганизмов ИНМИ АН СССР.
Минеральная среда. Для выращивания указанного штамма применяли среду следующего состава (г\л): Na2HPO4 - 6,0; KH2PO4-0,6; NH4Cl-1,0; MgSO4-0,2; CaCl2-0,02; Fe(NH4)2C6H5O7-0,012 и микроэлементы по Хогланду ( Веденина, 1968).
Определение газов. Соотношение Н2:О2 в суспензии растущих клеток водородных бактерий определили по методу, описанному ранее (Золотухин, 1969 г.). Расход и кинетику потребления СО2 растущей популяцией Hydrogenomonas Z-1 регистрировали методом, изложенном в другой работе (Золотухин, 1969б). Подачу всех газов в реактор производили из мерных цилиндров под давлением близким к атмосферному.
Описание установки. На рис.1 приведена схема установки для непрерывной регистрации содержания Н2, О2 и СО2 в суспензии растущих клеток водородных бактерий. Установка состоит из реактора (1) в который введены: платиновый электрод (2), рН-электрод (3), электроды сравнения (4 и 5), пробоотборник (6), железный сердечник для перемешивания (7) и ввод для газов (8); магнитной мешалки (9), усилителей (10 и 11) и автоматического многоточечного потенциометра (12).
Перед пуском установки в работу реактор вместе со средой (без микроэлементов, солей железа и кальция), пробоотборником, железным сердечником и вводом для газов стерилизуется в автоклаве при 1 атм. избыточного давления после чего стерильно вводятся в реактор. Затем стерильно добавляются микроэлементы, если кальция и железа и посевной материал, реактор герметизируется, электроды присоединяются к усилителям, последние - к автоматическому потенциометру. После этого включается магнитная мешалка и воздух в реакторе заменяется на смесь Н2, О2 и СО2 определённого состава. При этом считается, что в реакторе содержится только Н2, О2 и СО2, если при очередных сменах газовой фазы реактора показания электродов не меняются. Это положение принимается за исходной. Дальнейшие изменения показаний электродов и уменьшение давления в реакторе говорят о том, что началось потребление газов бактериями. Последующая подача газов в реактор производится в зависимости от того, какой газ в данный момент потребляется и в какой мере.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2 показана типичная картина, получаемая при раздельной подаче Н2, О2 и СО2 в реактор с одновременной регистрацией показаний Рt - и рН- электродов. Из этих данных видно, что изменения потенциала Рt - электрода очень чётко отражают изменения содержания водорода и кислорода в реакторе. При добавлении Н2 в реактор потенциал Рt - электрода смещается в отрицательную сторону, а при добавлении О2 - в положительную. Эти изменения не влияют на рН. Последний меняется только при уменьшении или увеличении СО2 в реакторе, с соответствующими подщелачиванием и подкислением среды, а также изменением давления в реакторе. Давление в реакторе также меняется и при изменении содержания Н2 и О2 (изменения давления на рис.2 не показаны).
На рис. 3 показаны изменения потенциала Рt - электрода и рН бактериальной суспензии при постоянном поступлении смеси Н2 + О2 с минимальным количеством кислорода (<10%) и периодическим добавлением СО2 в реактор. Эти данные указывают на то, что скорость потребления кислорода бактериями больше, чем скорость его поступления в реактор. Эта разница в скоростях приводит к полному истощению кислорода в реакторе, которое приводит к остановке роста биомассы и процесса фиксации СО2. Добавление О2 стимулирует эти процессы. Аналогичную картину также вызывает и накопление кислорода в реакторе выше оптимальных значений, но в этом случае после прекращения фиксации СО2 и роста биомассы потребление Н2 и О2 продолжаются (случай холостого окисления водорода).
То же самое относится и к углекислоте. Отсутствие СО2 в реакторе полностью затормаживает рост биомассы и значительно снижает потребление водорода и кислорода бактериями. Добавление СО2 в реактор стимулирует рост биомассы и увеличивает скорость потребления Н2 и О2. Таким образом предлагаемая установка даёт возможность проводить количественные опыты по изучению потребления Н2, О2 и СО2 растущей популяцией водородных бактерий, а также исследовать влияние концентраций данных газов и других веществ на их метаболизм.
Золотухин Н.В. 30.10.68г.
ЛИТЕРАТУРА
Веденина И.Я., 1968. Содержание основных компонентов клетки при автотрофном росте Hydrogenomonas Z-1. Микробиология, 37 вып.1.
Золотухин Н.В. 1969. Рост водородных бактерий при меняющихся концентрациях водорода и кислорода. Известия АН СССР (биол.)
Золотухин Н.В. 1969. Фиксация углекислоты растущей популяцией ей водородных бактерий. Известия АН СССР (биол.)
Foster J. and Zitchfield J., 1964. A continuons culture apparatus for the microbial utilization of hydrigen produced by electrolysis of water in closed-cycle spase. Biotechnol. Bioeng №6.
Schuster E. und Schltgel H., 1967. Chemolithotrophes Wachstum von Hydrogenomonas H16 im Chemostaten mit elektrolytischer Knollgaserzengung. Arch. fur lukrobiol. №58.
Подписи к рисункам
Рис.1. Схема установки для изучения потребления Н2, О2 и СО2 растущей популяцией водородокисляющих бактерий.
Рис.2. Одновременная регистрация изменений потенциала (1) и рН суспензии растущих клеток Hydrogenomonas Z-1 (2) при изменяющихся количествах Н2, О2 и СО2 в реакторе. Стрелками показаны моменты добавления в реактор: 1-4 - водорода, 5-7 - кислорода, 8,9 - двуокиси углерода. (Пояснения в тексте).
Рис.3. Изменения потенциала (1) и рН суспензии растущих клеток Hydrogenomonas Z-1 (2) под влиянием кислорода. Стрелками показаны моменты добавления в реактор: 1- смеси 93% О2 7%О2, 2-4 - двуокиси углерода, 5- кислорода (пояснения в тексте).
СТАТИЧЕСКИЕ И ДИНАМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОХИМИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА.
I. ВВЕДЕНИЕ
II. СТАТИКА ЖИВОЙ КЛЕТКИ
1. Определение понятий
2. Элементарный состав живой материи
3. Молекулярный состав клетки
4. Надмолекулярный состав клетки
5. Клетка как основная структурная единица живого
III ДИНАМИКА КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
А\ Необходимые условия для жизнедеятельности клетки
1. Определение понятий
2. Источник энергии
3. Источник водорода
4. Источник азота
5. Источник углерода
6. Источник фосфора и других элементов
Б\ Достаточные условия.
1. Определение понятий
2. Физико-химические свойства среды
3. Концентрация исходных компонентов
4. Активность ферментных систем
5. Мутагенные факторы и их роль в устойчивости клеточного метаболизма
В\ Метаболизм клетки
1. Определение понятий
2. Трансформация энергии и пути её распределения в клетке
3. К.П.Д. энергетического аппарата клетки и формы энергетических потерь.
4. Биосинтез клеточных компонентов:
а) белковых веществ
б) нуклеиновых кислот
в) липидов
г) сахаров и запасных веществ
д) "биосинтетические потери"
5. Связь между скоростями энергобио синтетическими процессами и концентрациями:
а) исходных продуктов
б) промежуточных соединений
в) конечных компонентов клеточного метаболизма.
6. Индукционный характер энергетических и синтетических процессов:
а) "энергетические" индукторы
б) "синтетические" индукторы
7. Связь между энергетическими и синтетическими процессами в клетке:
а) взаимозависимость био энергетических и биосинтетических процессов
б) связь белкового и других синтезов с работой энергетического аппарата.
в) энергия как естественный регулятор направленности клеточного метаболизма.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ
Биохимическое (микробиологическое) производство жизнедеятельности основано на одноклеточных организмов (дрожжей, бактерий, грибов, водорослей и др.), в результате которой образуется сами клетки и продукты их метаболизма (обмена).
Как известно, мощный подъём и развитие производства мяса и молока и других продуктов животноводства требует также мощного развития кормовой базы. Очевидно, что из-за ограниченности сельхозугодий, объём продукции животноводства при использовании традиционных кормов также ограничен. Поэтому встала проблема увеличения продуктов животноводства без расширения площадей под посевы кормов для сельскохозяйственных животных. Решение этой проблемы (в самом общем виде) уже найдено и оно заключается в использовании микроорганизмов для переработки различных промышленных и сельскохозяйственных отходов и определённого набора минеральных солей в продукты, которые могут служить в качестве высокопитательного корма для животных, а в перспективе - компонентами питательного рациона человека.
Наиболее перспективным продуцентами кормового белка или "белково витаминного комплекса" (БВК) считаются в настоящее время дрожжи, бактерии и одноклеточные водоросли.
Наиболее перспективным сырьём при этом считаются: углеводороды нефти и гидролизаты - для дрожжей, вода, углекислый газ и азот воздуха - для водородных бактерий, природный газ для метанокисляющих бактерий, углекислота и солнечный (или другой свет) - для хлореллы.
Несмотря на разнородность микроорганизмов и исходного сырья для их жизнедеятельности, проблема получения их массы для скармливания животным сводится, в конечном итоге, к управлению ростом множества клеток, находящихся в том или ином объёме питательной среды. Кроме того, морфологические различия, которые имеют данные микроорганизмы, не адекватны их молекулярной организации, их био химизму, их качественному биохимическому составу. Иными словами, во всех этих различных формах представителей одноклеточных организмов обнаруживаются адекватные и тождественные системы не только по своим функциональным свойствам, но и по структурной организации. К таким системам относятся балки (ферменты, катализаторы), нуклеиновые кислоты (носители наследственной информации) и другие соединения, без которых процесс жизнедеятельности практически невозможен. Наличие содержания белковых веществ в клетках указанных микроскопических существ и высокой скорости их синтеза клетками, даёт основание для мощного развития биохимического производства с целью ликвидации белкового дефицита. Данное производство обладает, кроме того, ещё одним неоспоримым преимуществом: оно ограничено по площади и практически не ограничено в объёме производимой продукции.
Таким образом, для успешного и быстрого развития высокопроизводительного, автоматизированного биохимического производства кормов крайне необходимо знать статическую и функциональную организацию одноклеточных организмов (дрожжей, бактерий и др.), выяснить механизмы, регулирующие одномоментное происхождение сотен и тысяч элементарных реакций, конечным результатом которых являются все структурные и функциональные компоненты клетки, существующие и синтезирующие вновь.
II. СТАТИКА ЖИВОЙ КЛЕТКИ
1. Определение понятий: Статикой живой клеткой будем называть её химический и биохимический состав, а также физические свойства, составляющих её компонентов, которые получаются в любой фиксированный момент её жизнедеятельности.
2. Живой. Клетку будем называть тогда, когда имеют место устойчивые во времени изменения её массы, а также химических и физических параметров.
III. ЭЛЕМЕНТАРНЫЙ СОСТАВ ЖИВОЙ КЛЕТКИ
Несмотря на неограниченный полиморфизм представителей живой природы на Земле, в функциональном спекте на молекулярном уровне наблюдается не только универсализм, изоморфизм в организации, но и полная тождественность в их элементарном, химическом составе.
Всё живое, как правило, содержит углерод. Данный элемент составляет около 50% от общего веса сухой биомассы.
Всё живое, как правило, содержит в себе азот. Данный элемент составляет от нескольких процентов ( в "жирных" объектах) до 15% (в "нежирных" объектах) от общего веса сухой биомассы.
Всё живое, как правило, содержит водород, играющий очень важную роль у всех представителей живого и входящий в структуру живого. Содержание его в сухой массе клеток составляет около 5%.
Всё живое, обязательно содержит серу, фосфор, железо, калий, натрий. Количество их определяется конкретным объектом и его физиологическим состоянием.
Кислород также является обязательным структурным компонентом живого и содержание его в сухой клетке составляет около 20%.
Вышеперечисленные химические элементы называются макроэлементами. Кроме данных элементов, живая материя содержит ещё несколько десятков членов периодической системы Менделеева, которые составляют менее 1% от общей массы живой материи и именуются микроэлементами.
Таким образом, живая материя организована только из известных химии элементов и обязательно содержит в себе макроэлементы. Эти элементы соединялись между собой в различные комбинации, образуют следующую ступень организации живой материи - молекулы.
III. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ СОСТАВ КЛЕТКИ
Любая клетка состоит из множества молекул различных по своей химической природе и биологической функции. Установлено, что основными молекулами, обеспечивающими прохождение жизнедеятельности, являются: а) белковые вещества, б) нуклеиновые кислоты, в) липиды (жиры и им подобные вещества), углеводы, начиная от простого сахара, глюкозы - и кончая высокомолекулярными соединениями - полисахаридами целлюлоза крахмал и пр.)
Белки - сложные органические вещества, образуемые из аминокислот. Количество последующих в настоящее время известно около 25. Данные кислоты состоят из углерода, азота, водорода и кислорода. Различная их количественная комбинация даёт конкретную аминокислоту. Последние, полимизируясь в определённой последовательности и численности, образуют молекулы белков. В настоящее время открыто около 3000 различных видов белковых веществ.
Почти все белки - ферменты, т.е. те самые катализаторы, которые осуществляют весьма быстрые, многоступенчатые реакции по превращению различных субстратов в конкретные продукты жизнедеятельности клетки. Сами белки синтезируются также весьма быстро: например, у бактерий белок среднего молекулярного веса синтезирует за 5 секунд, а число молекул субстрата, которое может "переработать" фермент достигает несколько сотен тысяч в 1 секунду. Отсюда вытекает чрезвычайная важность непрерывного контроля за ходом белкового синтеза в биохимическом производстве и создания соответствующей АСУ.
Нуклеиновые кислоты. Данные соединения разделяются на 2 класса: 1) десоксирибонуклеиноваые (ДНК) и 2) рибонуклеиновые (РНК) кислоты. Эти кислоты представляют собой сложные соединения, состоящие из атомов углерода, азота, водорода, кислорода и фосфора. Данные элементы в определённой комбинации образуют с начала нуклеотиды - предшественники нуклеиновых кислот. Число их видов равно. 3) Различная комбинация нуклиидов вместе с сахарами (рибозой или дезоксирибозой) и фосфорной кислотой даёт либо ДНК, либо РНК.
Роль ДНК, как считается в настоящее время, сводится к хранению наследственной информации клетки, которая характеризует её синтетические потенции и, следовательно, видовую принадлежность.
Роль РНК - обеспечение белкового синтеза в клетке по программе, заложенной в ДНК.
Липиды - обширный класс соединений, которые, наряду со свободным своим состоянием, входят также в мембранные и др. структуры клетки. Эти струткуры играют исключительную роль в трансформации энергии, поступающей извне (например, в виде различных органических соединений), в формы, доступные для жизнедеятельности. Сами липиды также могут служить источником энергии, углерода, водорода и кислорода в биохимической "машине" клетки.
Элементарный состав липидов - углерод, водород, кислород. Комбинация этих химических элементов, осуществляемая ферментами, в определённой числовой последовательности, образует довольно обширный класс жиров и жироподобных веществ клетки.
Углеводы - данные вещества, как и липиды, состоят из углерода, водорода, кислорода, но содержат значительно больше последнего. Углеводы выполняют ключевую роль во многих синтетических и энергетических процессах клетки, являясь часто для первых исходным продуктом (например, в процессах брожения с целью получения спирта) и таковым, а также и конструктивным веществом в воспроизводстве самих клеток, например, при производстве дрожжей из гидро лиатов. Кроме того, углеводы, полимеризуясь выполняют функцию запасных веществ (гликоген, крахмал) и играют механическую роль (в случае клетчатки или целлюлозы).
Кроме перечисленных молекул, в живой клетке имеется большой набор различных органических кислот и других химических соединений. Данные вещества, в основном, являются проектными компонентами в многочисленных энергетических и синтетических процессах функционирующей клетки.
4. НАДМОЛЕКУЛЯРНЫЙ СОСТАВ КЛЕТКИ
Молекулы белка, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и др. в клетке ассоцированны в определённые структуры. Так, например, нуклеиновые кислоты (ДНК) с белками образуют сложные, устойчивые структуры, называемые хромосомами. В клетках животных и растений хромосомы обычно располагаются в ядре. В микробных клетках, в том числе и дрожжах хромосомы находятся в диффузном состоянии и никогда не дают ядерных чётких образований. Хромосомы, по современным представлениям, содержат и передают всю наследственную информацию.
Следующими, очень важными надмолекулярными структурами любой клетки являются рибосомы - "фабрики белка". Их образуют белки и рибонуклеиновые кислоты. Данные микроструктуры клетки выполняют роль создателей новых белков по программе, эодированной в хромосомах. Причём, количество рибосом в клетке прямо коррелирует с её белково ситетической активностью. Это говорит о том, что рибосомы как белки, имеют своё время жизни и в процессе жизнедеятельности клетки должны постоянно воспроизводится.
Любая живая клетка представляет собой микрообъём, который отделён от окружающего пространства мембраной. Последняя представляет собой трёхслойное образование, два внешних слоя которого белки, внутренние - липиды. Кроме внешних мембран, клетка имеет многочисленные внутренние мембраны, которые играют очень важную роль в энергетике клетки. Они подобны конденсаторам - на их поверхности создаётся потенциал за счёт свободной энергии субстрата. Данный потенциал затем реализуется в процессе образования "биологических" форм энергии. Следует ещё отметить тот факт, что внешние мембраны выполняют ещё одну очень важную роль - они регулируют проницаемость различных веществ внутрь клетки и из неё, наружу.
5. КЛЕТКА КАК ОСНОВНАЯ СТРУКТУРНАЯ ЕДИНИЦА ЖИВОГО
Как известно, все растения и животные имеют клеточную структуру. Клетки растений и животных, как установлено, за последние 10-15 лет, имеют больше сходства, чем различия. Их общность особенно заметна в молекулярной организации и в средствах реализации всех основных свойств живого в процессе жизнедеятельности. Это также относится и к одноклеточным организмам.
Таким образом, по современным представлениям, клетка рассматривается как основная структурная и функциональная единица живого. Это значит, что клетка обладает всеми основными принципами структурной организации, присущими живой материи на всех уровнях её организации. Различие между клеткой и организмом заключается в их функциях, т.е. организм более полифункционален, чем клетка.
6.ДИНАМИКА КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
А\ Необходимые условия
1. Определение понятий
Метаболизмом клетки называют совокупность реакций и процессов, обеспечивающих её жизнедеятельность.
Динамикой метаболизма будем называть временную последовательность энергетических и синтетических реакций и процессов в жизненном цикле клетки, т.е. от одного её деления до другого.
2. Источник энергии
Все процессы жизнедеятельности идут с определёнными энергетическими затратами. Поэтому одним из необходимых условий для жизнедеятельности является наличие определённого количества энергии в доступной, для конкретного процесса, форме. Наиболее универсальной биологической формой энергии является аденозинтрифосфорная кислота - АТФ, которая образуется в первичных процессах трансформации энергии, поступающей в клетку извне.
Источником энергии для фотосинтезирующей клетки, как известно, является энергия квантов солнечной радиации. Эта энергия в процессе фотосинтеза идёт на синтез всех компонентов, из которых построен фотосинтезирующий организм, аккумулированная таким образом энергия квантов солнечного света используется затем животными и человеком в виде пищи растительного и животного происхождения.
В случае, например, гидролизных дрожжей, источником энергии для их роста и размножения служат сахара, которые получаются в процессе распада продуктов фотосинтеза - целлюлозы.
Кроме указанных случаев, источниками энергии для жизнедеятельности могут быть белки, липиды, гликоген, крахмал, различные спирты, углеводороды нефти, водород, сероводород и ряд других неорганических веществ.
По типу используемого источника энергии клетки и организмы делят на:
1) автотрофные - те, которые в качестве источника энергии используют либо солнечный свет \фото атотрофы\, либо различные неорганические вещества \хемоавтотрофы\:
2) гетеротрофные - те, которые в качестве источника энергии используют различные вещества органической природы.
3. Источник водорода
Водород играет очень важную роль не только в структурной организации живой материи, но и является исходным или промежуточным источником энергии в реакциях синтеза АТФ. Поэтому он также является необходимым компонентом в метаболизме клетки.
Источником водорода для фотосинтезирующих клеток является вода, которая в процессе аккумуляции энергии квантов солнечного излучения подвергается электролизу. При этом образуется Н2 и О2. Часть кислорода фотосинтезирующие клетки используют в процессах дыхания, т.е. синтеза АТФ, а другую часть - выбрасывают в окружающее пространство.
Для гетеротрофных клеток источником водорода служат органические вещества, от которых данный элемент отщепляется при помощи соответствующих ферментов.
Кроме перечисленных случаев, в природе имеется большое разнообразие одноклеточных организмов, которые в своём метаболизме используют молекулярный водород.
4.Источник азота
Как уже отмечалось выше, азот клетки используют в синтезах белков, нуклеиновых кислот и других соединений. При этом основная масса многоклеточных и одноклеточных организмов использует азот в связанном виде. Простейшей формой такового является аммиак. Однако в природе существуют бактерии, которые способны использовать в своём метаболизме молекулярный азот \из воздуха, например\. Всё же гетеротрофные организмы и клетки используют в качестве источника азота для своей жизнедеятельности различные азотосодержащие вещества органического происхождения.
5. Источник углерода
Всё живое на Земле построено на основе соединений углерода. Поэтому наличие его источника является необходимым условием существования для всех представителей земной жизни.
В случае автотрофных организмов в качестве источника углерода используется углекислый газ. В случае же гетеротрофных организмов источником углерода служит обширный класс органических веществ начиная от простейшего соединения - метана - и кончая такими сложными соединениями как белки, липиды, полисахара и т.п.
6. Источник фосфора и других элементов
Фосфор \ в виде остатка фосфорной кислоты\ входит в структуру живой материи. Кроме того, он выполняет исключительную роль в энергетике клетки, где он участвует в процессах аккумуляции, переноса и передачи свободной энергии внешнего источника в соответствующие реакции и процессы. Очевидно, что наличие данного компонента в клетке является такие необходимым условием для её жизнедеятельности.
В качестве источника фосфора на практике обычно используют соли фосфорной кислоты.
Не менее важную роль в процессах жизнедеятельности играет также микроэлементы. В клетках они обеспечивают функционирование различных белков - ферментов в энергетических и синтетических процессах.
Источником микроэлементов являются различные минеральные соли.
Б\ Достаточные условия.
1. Определение понятий. Ионный слой раствора (применительно к электролитам) называют произведение концентрации того или иного иона на квадрат его валентности.
Физико-химическими условиями питательной среды для микроорганизмов будем называть совокупность физических и химических параметров (т.рН, Ен, Сиj), характеризующих тот или иной раствор или суспензию.
Обозначения:
Т-температура
рН- кислотно-щелочные свойства среды
Ен- окислительно - восстановительный потенциал среды
С - концентрация компонента среды
j - ионная сила раствора
Активность фермента (или системы ферментов) называют число молекул исходного вещества, преобразуемое ферментом в единицу времени (1 мин.)
Мутагенными факторами называют любые воздействия на генетический аппарат клетки, приводящие к изменениям её наследственных свойств.
2. Физико-химические свойства среды
Для прохождения процессов жизнедеятельности ( в микробной клетке, тканях, органах и организмах т.д.) среда обитания биологических объектов должна удовлетворить определённым требованиям. Например, для жизни одноклеточных организмов (дрожжей, бактерий и т.д.) необходимо наличие воды, содержащей в свою очередь: источники энергии, углерода, водорода, кислорода, фосфора и т.д. Кроме того, концентрации питательных компонентов в воде должны строго коррелировать с концентрацией живущих в ней микроорганизмов.
Как правило, большинство питательных и других компонентов среды микробов являются электрически активные, т.е. имеют определённый заряд. Например источником азота для дрожжей служит одновалентный положительный ион - NH3+, а источником серы, желез, меди - 2-х валентные- SO4-2, Fe2+, Cu2+ - разноимённые заряды.
Сумма всех произведений концентрации каждого компонента среды на квадрат его валентности даёт нам ионную силу питательного раствора. Очевидно, данная величина имеет в "оптимуме" свою нижнюю и верхнюю грань. Причём, для каждой конкретной концентрации живущих микроорганизмов значение нижнего и верхнего предела будут различны.
Например, для высоких концентраций дрожжей (>102\л) ионная сила питательного раствора должна быть выше, чем для низких (<12\л).
Таким образом, одним из достаточных условий для жизнедеятельности множества клеток является соответствие ионной силы питательного компонента раствора, (содержащего при этом и все необходимые компоненты) концентрации клеток меняет свою нормальную направленность вплоть до полной своей остановки из-за разбаланса в скоростях энергетических и синтетических реакций.
В литературе обычно по физико-химическим условиями среды понимают только Т, рН и Ен. Поэтому на практике управление сводят к регулированию значений этих параметров в ходе микробио синтеза. Покажем не информабельность этих параметров в данном случае. Возьмём дистиллированную воду в объём 1 моль, которая имеет следующую характеристику: Т=+250С, рН=7, Ен=25дмв. Поместим в неё буфер, который имеет такую же характеристику за исключением того, что в нём содержится 1М NaH2PO4 и 0,1M K2HPO4 . Ионная сила: воды jв=10-7(1)2 + 10-7(1)2 =2*10-7 раствора: jр= 1*(1)2+1*(1)2+0,1*2*(1)2+0,1*1*(2)2=2,6
3. Концентрация исходных компонентов
Очевидно, что для любого процесса необходимы исходные "возмущающие" силы. В микробио синтезе таковыми являются концентрации компонентов, служающие исходными для энергетических и синтетических процессов клетки. Значения данных величин в опыте могут меняться от нуля до какого-то определённого предела насыщения. Те значения концентраций компонентов среды, которые дают ионную силу, соответствующую максимальной скорости синтеза и, следовательно, использования нейтральных компонентов, можно назвать оптимальными. Вероятно, оптимум (данный) для различных микробных культур будет неодинаков.
4. Активность ферментных систем
Активность ферментных систем, как указывая Н.Д. Иерусалимский, определяется "узким звеном" в цепи превращений исходных компонентов в конечные продукты жизнедеятельности. Поэтому оптимизация микробио синтеза, вероятно, должна быть направлена на устранение узких мест. При этом, очевидно, все остальные ферменты должны всегда находится в активном состоянии независимо от данных звеньев. Это можно назвать достаточным условием для ферментативного катализа, т.е. превращения наличного субстрата в конечный продукт.
5. Мутагенные факторы
В качестве мутагенных факторов в биохимическом производстве могут быть различные примеси, находящиеся в сырье. Поэтому отсутствие данных факторов "при прочих равных" условиях является достаточным условием для стабильного устойчивого получения однородных дрожжей или других микробов. Наличие же мутагенных факторов может привести или к полной гибели дрожжей или к колебаниям в их росте с амплитудой, величина которой, вероятно, будет носить случайный характер.
В. Метаболизм клетки
Любое микробиологическое производство имеет дело со множеством одноклеточных организмов, концентрация которых в 1 мл можно достигать 10х10 6 клеток. В каждой из этих клеток одновременно осуществляется до нескольких тысяч элементарных реакций в 1 сек. Достаточно указать на то, что средняя (по весу) белковая молекула синтезируется за 5 сек., а активность некоторых ферментов достигает 106 и более молекул субстрата в 1 мин. Причём, синтез клеточных компонентов осуществляется сотнями различных ферментов, которые могут функционировать одновременно.
В литературе динамику микробного метаболизма обычно характеризуют удельной скоростью синтеза биомассы. Удельная скорость является отношением прироста клеточной массы к общей исходной массе в единицу времени и обозначаются через м. Или в аналогической форме:
м=m\m0*t (час-1), где
m - прирост клеточной массы, г;
m0 - исходная масса, г
t - время, час
Но, как уже отмечалось выше, массу клетки составляют конкретные биополимеры и др. вещества. Поэтому более правильным будет рассматривать м как сумму удельных скоростей синтеза белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и т.д., каждый из которых имеет свой исходный субстрат и требует определённых энергозатрат. Аналитически это можно представить в виде:
м=м1+м2+м3+.....мn
где: n - число конкретных синтезируемых компонентов клетки.
Очевидно, что при отсутствии какого нибудь субстрата, определённые мi будут равняться нулю (0). Этому же значению может равняться и м в случае, например, отсутствия источника энергии для жизнедеятельности.
Таким образом исследование динамики клеточного метаболизма сводится к исследованию скоростей синтеза клеточного компонентов с учётом временной последовательности реакции и процессов, а также концентрация исходных, промежуточных и конечных продуктов в общей ферментной системе клетки.
Процесс жизнедеятельности клетки схематично можно представить следующим образом:
Такое представление даёт возможность увидеть связи между "входными" и "выходными" параметрами. Приведём некоторые из них:
1) процесс жизнедеятельности прекратится, если на входе будет отсутствовать энергия т.е. на выходе ничего не будет - 0:
2) синтез азотосодержащих соединений (белков, аминокислот, нуклеиновых кислот может остановиться в двух случаях:
а) когда отсутствует источник азота, а все остальные входные компоненты есть;
б) в присутствии азота и других компонентов питания, если работы энергетической системы клетки ограничены из-за ослабленного потока электронов в цели преобразования энергии субстрата.
3) при перенапряжении в работе энергетических систем клетки биосинтез может полностью прекратится, хотя потребление источника энергии клеткой может продержаться. В этом случае говорят, что энергетические и синтетические процессы разобщены.
Как уже отмечалось выше, энергия, поступающая в клетку в виде квантов света или различных химических соединений, транспортируется в её биологические формы. Таковыми являются АТФ и восстановленные формы переносчиков водорода (ВН2). В таком виде энергия затем используется в биосинтезах, в транспорте веществ против термодинамического потенциала к месту участия их в реакциях, в различных механохимических процессах и т.д. Схематично этапы преобразования энергии внешнего источника в соответствующие её формы клетки можно представить следующим образом:
Таким образом, энергия внешнего источника попадая в клетку претерпевает сложные изменения, после которых образуются её биологические носители - АТФ и ВН. Причём, АТФ является более универсальным источником энергии в процессах жизнедеятельности клетки, чем переносчик водорода - ВН2. Последний участвует только в синтезах, а АТФ кроме этого, поставляет энергию и в синтетические процессы.
3. КПД энергетического аппарата клетки и формы энергетических потерь
К.П.Д. биологической системы на практике определять довольно сложно и не всегда удаётся это сделать. Тем не менее, в первом приближении его можно рассчитать по количеству образующихся АТФ и ВН2 при использовании единицы энергетического субстрата. Была предложена следующая формула для расчёта к.п.д. одноклеточных организмов.
Ех=к1*Е1+к2*Е2\ Е0
где: Ех - к.п.д. живой системы на уровне образования АТФ и ВН2
Е1 - количество свободной энергии внешнего источника, затраченное на синтез АТФ;
Е2 - количество свободной энергии внешнего источника, затраченное на синтез ВН2
к1 - к.п.д. образования АТФ, равный 0,48
к2 - к.п.д. образования , равный 0,92
Е0 - общая свободная энергия внешнего источника.
Как показали расчёты, каждому конкретному состоянию живых микроорганизмов соответствует вполне определённое значение к.п.д. Наиболее высокий к.п.д. (0.9) получается тогда, когда клетка синтезирует липиды. В этом случае затрагивается в основном ВН2, который сам образуется при довольно высоком значении к.п.д. Наиболее низкий (0,4-0,5) к.п.д. живой клетки получается при активном синтезе его белковых соединений.
Кроме того, к.п.д. также может принимать самые различные значения, начиная от 0 и кончая 0,9. Причём, нулевые значения данной величины получаются при разобщённом энергетических и синтетических процессов клетки, т.е. в данном случае вся энергия внешнего источника рассеивается в окружающее пространство.
Основными потерями энергии в микробиосинтезе является тепло. При этом чем больше тепло выделяется при одном и том же расходе энергетического субстрата, тем менее эффективна работа биологической системы. Данные потери представляют собой сумму микро потерь, имеющих место в многочисленных элементарных актах переноса и передачи энергии в каждые конкретные реакции и процессы, обеспечивающие жизнедеятельность.
4. Биосинтез клеточных компонентов
На основании выше изложенного, можно заключить, что производство кормов и других продуктов на основе микробиосинтеза представляет собой совокупность многочисленных реакций образования всех компонентов микробной клетки, которые необходимы для её размножения.
а) Биосинтез белков. Этот процесс кратко можно представить следующим образом:
б) Биосинтез нуклеиновых кислот
в) Биосинтез липидов
г) Биосинтез сахаров и других веществ. Схема синтеза данных соединений такая же что и для веществ типа СНО
БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПОТЕРИ
Основными биосинтетическими потерями в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, например, дрожжей в условиях "оптимума" являются вода. В случае разбаланса энергетики и биосинтеза дрожжи начинают выделять в среду вещества, которые в таких условиях могут находится в клетках в избытке.
Н.В. ЗОЛОТУХИН
ОБ УСЛОВИИ ОБРАТИМОСТИ КИСЛОРОДНОГО ЭЛЕКТРОДА.
Одним из обязательных условий при работе с водородным электродом является удаление следов кислорода и углекислоты в растворе и используемом водорода \БЕЙТС, 1968\. Присутствие кислорода искажает результаты и нарушает закономерность изменения потенциала платинового электрода, описываемую уравнением Нернста. В отсутствии кислорода и других активных окислителей реакция распада водорода на протоны и электроны на поверхности платины - обратима.
Считается общепризнанным, что кислородная реакция на платине не обратима \1967\. В силу этого необратим и электрод Р, О2 \газ\.
Общеизвестно, что как водород, так и кислород активно взаимодействует с платиной. В случае водорода потенциал платинового электрода отрицательный, а в случае кислорода - положительный. Это свойство платины мы использовали при решении задачи по управлению процессами поглощения из водного раствора Н2 и О2 водородоокисляющими бактериями. В водных растворах, не содержащих окислителей и бактериальной культуре нами было установлено однозначное соответствие потенциала платинового электрода соотношению концентраций водорода и кислорода. Присутствие двуокиси углерода в смеси Н2 и О2 практически не меняла данного соответствия. Электродом сравнения в наших опытах служил хлорсеребряный электрод. Оба электрода погружали в водный раствор или бактериальную суспензию, находящиеся в стеклянной колбе. Смесь водорода и кислорода продували сквозь испытуемую среду, которая к тому же дополнительно перемешивалась магнитной мешалкой.
На рис.1 показаны результаты по установлению зависимости потенциала платинового электрода от величины Н2:О2. Как следует из этих данных, между потенциалом платинового электрода и соотношением концентраций Н2 и О2 существует линейная зависимость. Эта зависимость сохраняется как в случае увеличения концентрации кислорода в водороде, так и при её уменьшении. Чувствительность электрода к изменениям концентрации кислорода в водороде практически от времени не зависела, но зависела от тщательности его изготовления и подготовки его к работе.
Приведённые данные позволяют заключить, что, зная растворимость кислорода в том или ином растворе, можно определять его абсолютные концентрации при помощи платинового электрода в условиях обязательного присутствия водорода. Это же относится и к водороду. В отсутствии последнего кислород необратимо связывается либо с самой платиной, либо с различными загрязнениями, находящимися в газе или растворе. \1967\.
При работе с биологической средой \сложный раствор минеральных солей плюс растущие бактерии, непрерывно потребляющие эти соли\ платиновый электрод сохранял чувствительность к изменениям величины Н2:О2. Эти изменения создавались либо экспериментатором сознательно, либо за счёт неравномерного использования бактериями водорода и кислорода в герметичном объёме \Золотухин,1969 а.б.\. В этих опытах также была установлена независимость показаний платинового электрода от концентрации ионов водорода. Изменения показаний Р - электрода полностью определялись изменениями концентраций Н2 и О2, а изменения рН среды - концентрацией двуокиси углерода.
Следует отметить, что, в силу специфики наших экспериментов, значение потенциала платинового электрода \относительно стандартного водородного электрода\ меняли от +250 до -100мв, а концентрацию ионов водорода - от 10-7 до 10-9.
Независимость изменений потенциала платинового электрода от изменения рН среды в присутствии кислорода и водорода наводит на мысль о прямом взаимодействии Н2 и О2 на поверхности платины, но не с водой и её ионами. Результатом данного взаимодействия, вероятно, является образование нейтрального продукта \например, воды\, который уходит с поверхности платины в раствор. Возможно, что количество этого продукта незначительной и он вместе с кислородом и водородом образует на платине обратимую равновесную систему.
Таким образом, на основании описанного явления, можно заключить, что в присутствии водорода кислородный электрод является обратимым.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бейтс Р. 1968. Определение рН, теория и практика. "Химия". Л.
2. Даниэльс Ф., Р.Альберти. 1967. Физическая химия. "Высшая школа", М
3. Золотухин Н.В. 1969а. Изв. АН СССР, сер. биол. 3, 451
4. Золотухин Н.В. 1969б. Научн.докл.высш.школы, 7, 142
15.07.1972г.
УДК 663.1.015 (047)
НОВЫЙ И ПРОСТОЙ АППАРАТ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Н.В. Золотухин, ст.н.с., к.б.н., Э.М. Якубов, зав.лаб., к.т.н., А.В. Юлдашев, м.н.с., А.У. Исмаилов, к.б.н. УзНПО "Кибернетика" АН УзССР.
Конструктивными особенностями действующих и предлагаемых аппаратов для выращивания микроорганизмов является наличие в них перемешивающих и теплообменных устройств. Описание типичных конструкций данных аппаратов приведены в работе (1,2,3). Кроме того растительного сырья, предложен и апробирован вариант трубчатого аппарата, который показал хорошие технико-экономические показатели, но при низком коэффициенте наполнения (4).
Анализ работы предлагаемых и действующих аппаратов показывает, что их разработчики в основном преследует одну цель - как можно более интенсивно перемешивать жидкую культуру микроорганизмов с надеждой на получение желаемого биологического эффекта. Эта тенденция чётко выражена в аппаратах эрлифтной системы, в аппаратах с механическими мешалками, а также с вращающимися (6,7) и неподвижными перфорированными элементами (5). Интенсивное перемешивание, как правило, вызывает обильное пененея и снижает коэффициент наполнения аппарата, т.е. уменьшает его удельную производительность.
Развитие производства кормовых дрожжей при переработке различных гидролизных сред основывались на эрлифтный аппарат Лефрансуа (1).
Более совершенным видом воздухораспределения является аппарат системы Укрнииспа с децентрализованным воздухораспределением. В этих аппаратах рабочий объём составляет 1\3 часть полезного объёма.
Исходя из того, что микробные клетки в жидкой культуре даже при лёгком встряхивании быстро переходят во взвесь, нами были исследованы возможности обеспечения в таких условиях растущих микроорганизмов кислородом. На основе результатов этих исследований мы пришли к выводу, что наиболее эффективным способом доставки кислорода (воздуха) к местам роста микроорганизмов в жидкой среде является непрерывное пропускание его через толщу жидкости в виде мелких пузырьков. На основе этого был разработан и изготовлен аппарат с перфорированной системой газораспределения (8), устройство которого показано на схеме. Установленные в нём перфорированные диски позволяют увеличивать процесс-массообмена между воздухом и культуральной жидкостью без интенсивного перемешивания среды.
Как видно из схемы, все компоненты питания микроорганизмов подаются в коническую часть аппарата. Она в данном случае выполняет роль камеры смешивания жидкости и газа. На пути движения жидкости и газа вверх установлены плоские перфо элементы с диаметром отверстий 8-10 мм и общей площадью перфорации 30-45%. Причём, в цилиндрической части аппарата между перфо элементами и стенкой ёмкости имеются круговые зазоры. Они необходимы для циркуляции микробной культуры по контуру "верх-низ-верх". Многоярусное расположение перфо элементы необходимо для того, чтобы исключить возможность образование крупных пузырей газа и увеличить поверхность контакта газа с жидкостью.
Аппарат данной конструкции был изготовлен в трёх вариантах: ёмкостью 10л, 1200л, и 50 м3. Испытания проводили на Янгиюльском биохимическом заводе. При этом использовались промышленные среды и штаммы дрожжей. Во всех случаях получили одинаковые результаты. Аппарат работает следующим образом.
После заполнения аппарата и достижения необходимой концентрации микроорганизмов в условиях периодического процесса начинается непрерывная подача питательной среды через трубопровод 3, воздуха 4, аммиачной воды 5, пара 6 при снижении температуры от заданного уровня, вывод отработанного воздуха через вытяжной трубы 11 и готового продукта через 10. Внутри аппарата между перфорированными дисками 8,9 осуществляется циркуляция среды, а воздуха через все перфо элементы 7,8,9. Не интенсивное перемешивание культуральной среды и расход воздуха позволяют уменьшить пенную фазу.
При чистке аппарата подаётся острый пар и холодная вода. Аппарат ёмкостью 1200 л уже около года работает в качестве регенератора чистой культуры, полностью заменив при этом малую и большую дрожжанки общим объёмом около 7 м3.
Испытания аппарата ёмкостью 50 м3 с размерами по высоте - 5м и по диаметру - 4м показали, что микробиологическое состояние дрожжевых культур хорошее.
Ниже в таблице приведены технико-экономические показатели работы аппарата с децентрализованной системой воздухо определения и нового аппарата с использованием смешанных гидролизатов растительного сырья (опилки + хлопковая шелуха+рисовая лузга).
х-высокое значение скорости разбавления базового объекта обусловлено сбросом значительного количества из аппарата отработанной среды в канализацию, минуя стадию геппарации;
жж- значение концентрации дрожжей определяют в пенной фазе после его конденсации, а в новом аппарате текущая концентрация дрожжей определяли в жидкой фазе. Как видно из таблицы удельная производительность нового аппарата при выращивании дрожжей на промышленной среде и коэффициент накопления при этом соответственна в 1,5 и 2 раза выше, чем у аппаратов с децентрализованной системой подачи воздуха, а расход энергии (воздуха) для аэрации микробной культуры у нового аппарата в три с лишним раза ниже.
Следует особо отметить, что рост дрожжей в данном аппарате не сопровождался нагреванием среды температура которой постоянно имела тенденцию к снижению. Поэтому для поддержание необходимого температурного режима периодически приходилось подавать пра в воздухопровод. Иными словами, надобность в теплообменнике в данном случае отпала. Кроме того, конструкция аппарата и схема подачи в него питательной среды и воздуха, а также отбор дрожжей сверху, позволяют работать на более высоких концентрациях субстрата в исходной среде. Поэтому производительность аппарата прямо пропорциональна концентрациям питательных компонентов в поступающей среде. Что же касается габаритов аппарата, то максимальная его высота, по-видимому, не должна превышать 6м, если воздух берётся от серийной воздуходувке, дающей 0,6 атм.
Таким образом, обсуждаемый аппарат даёт возможность снизить в 2-3 раза металл и энергозатраты и во сколько же раз увеличить удельную производительность. Изготовление же данной конструкции в антикоррозийном варианте значительно повышает время его эксплуатации, надёжность в работе и сократит число и объём ремонтных работ, т.к. внутри аппарата ничего нет кроме перфо элементов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреев А.А., Брызгалов Л.И. Производство кормовых дрожжей. м, лесная промышленность, 1970
2. Технология гидролизных производств В.И. Шариков, С.А. Сапожницкий, О.А. Дмитриева и др., лесная промышленность, 1973.
3. Виесту У.Э., Кристапсонк М.Ж., Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. М, "Пищевая промышленность" 1980.
4. Надеждина А.В,, Воинов В.А., Головин В.В., Дмитриенко Л.В., Токарев Б.И. "Гидролизная и лесотехническая промышленность" №4, 1978.
5. Пат. США, №3743582
6. Авт.св. СССР №510504
7.Авт.св. СССР №523929
8. Авт.св. СССР №753894
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ
Золотухин Николай Васильевич,
Якубов Эркин Магрупович,
Минина Валентина Сидоровна,
Шубин Александр Петрович и
Шакиров Гумар Каюмович.
М.кл. С12
Изобретение относится к бродильному производству, к способу получения биомассы дрожжей и других микроорганизмов.
Известны способы получения биомассы микроорганизмов (пат. США №3846246 МК С12 в 1\14, НК 195-109 и завязка Франции № 2258447 МК С12в 1\18) по которым, с целью снижения затрат на пеногашение, воздух в ферментер вдувают со скоростью 14-32 см\сек.
Недостатком данных способов является то, что они не учитывают необходимости поддержания определённого количества воздуха непосредственно в культуральной жидкости по всему объёму для обеспечения непрерывности роста микроорганизмов, поскольку скорость вдувания воздуха в ферментер не гарантирует обеспечения кислородом микробных клеток в каждой точке рабочего объёма. Это приводит к нестабильности роста микроорганизмов и производительности аппарата.
Целью настоящего изобретения является разработка способа стабилизации роста микроорганизмов в ферментере и снижения затрат на пеногашение.
Поставленная цель достигается путём выращивания микроорганизмов в аппарате, описание которого дано в заявке за №2526827\28-13. Конструкции данного аппарата позволяет входящий газ дробить на отдельные пузырьки и равномерно распределять их по всему рабочему объёму аппарата и, следовательно, равномерно насыщать всю микробную культуру кислородом или другим газом. При этом насыщение среды газом определяется не только скоростью подачи газа (воздуха) в аппарат, но и общим объёмом газовых пузырьков, находящихся в жидкости. Данный объём в указанном аппарате можно значительно менять при одной и той же скорости подачи газа, так как аппарат имеет несколько входов для его подачи.
Сущность изобретения заключается в следующем. На внутренней стороне аппарата устанавливают калиброванную линейку, изготовленную из нейтрального материала, например, из нержавеющей стали с ценой деления до десятых долей общего объёма ёмкости. После этого аппарат соответствующим образом подготавливают к работе, т.е. заполняют его средой и вносят в неё посевной материал. После этого включают систему подачи воздуха так, чтобы общий объём газовых пузырьков (его определяют по калиброванной линейки) составлял не менее 1% от общего объёма жидкости, если исходная концентрация микроорганизмов в среде составляет не менее 1г\л среды. Если данная концентрация будет больше, то объём газовых пузырьков увеличивают до тех пор, пока среда не начнёт вспениваться. Если среда начинает вспениваться, то уменьшают объём газа в жидкости до тех пор, пока пение не прекратится. Уменьшение или увеличение объёма газовых пузырьков производят за счёт изменения количества подаваемого газа через тот или иной его вход, но без полного его перекрытия.
Далее процесс ведут следующим образом. Периодически определяют концентрации биомассы и субстрата и вычисляют соответственно их скорости увеличения и уменьшения. Если скорость синтеза биомассы примерно постоянна и соответствует времени её удвоения для испытуемого вида микроорганизмов и пененея среды не происходит, то объём газовых пузырьков в жидкости не меняют. Если же синтез биомассы замедляется, а концентрация субстрата остаётся достаточно высокой, то объём газовых пузырьков в культуральной жидкости увеличивают до тех пор, пока указанная величина не займёт заданного значения. Увеличение объёма газовых пузырьков можно ступенчато или одномоментно до начала пененея среды.
Пример. Необходимо получать биомассу дрожжей при выращивании их на гидролизных средах, которые (среды), как известно, сильно пенятся при интенсивном их перемешивании с микроорганизмами или без них. Гидролизаты растительных веществ обычно содержат около 3,5 % (35 г\л) редуцирующих веществ (РВ-сахара, органические кислоты и пр.).
Для выращивания дрожжей по предлагаемому способу гидролизат, после его нейтрализации и обогащения минеральными солями (фосфором и азотом), разбавляют водой до концентрации РВ равной 1,5 - 2%. После этого аппарат наполняют данной средой до отметки 90% от его объёма. Вносят туда посевной материал в количестве не менее 1 г\л и включают подачу воздуха в таком режиме, чтобы общий объём газовых пузырьков составлял примерно 0,1% от объёма среды, находящейся в аппарате. Затем периодически (через 0,5-1 час) определяют концентрации биомассы и РВ. Если при этом пененея нет, а дрожжи растут медленно, то объём газовых пузырьков в среде увеличивают до момента начала пененея среды. Снова определяют концентрации биомассы необходимо прямо пропорционально увеличивать объём газовых пузырьков. При этом с увеличением концентрации биомассы на 1г в литре, объём газовых пузырьков в жидкости необходимо увеличивать на 0,1 - 0,2%.
По достижении концентрации биомассы значения, соответствующего минимальной концентрации субстрата, при которой именно субстрат, а не кислород начинает тормозить биосинтез, процесс переводят на непрерывный режим, т.е. при установившейся концентрации биомассы и объёма газовых пузырьков в среде в аппарат начинают непрерывно подавать питательную среду, содержащую 1,5-2% РВ и соответствующее количество минеральных солей. Данное количество РВ соответствует 7,5-10г\л дрожжей (по сухой биомассе) и примерно 1,5-2% газовых пузырьков от общего объёма культуральной жидкости.
Пример 2. Необходимо получать биомассу дрожжей на гидролизных средах, содержащих 10% (100г\л) РВ или среда, содержащих такое же количество сахаров, т.е. выход дрожжей на таких средах должен составить 50 г\л цифра, обычно получаемая на практике, т.е. выход дрожжей с 1г РВ или сахара составляет 0,5г).
В данном случае процесс начинают также, как и в первом примере. Но после перевода процесса на непрерывный режим концентрации дрожжей в культуральной жидкости из-за большого количества поступающего субстрата будет продолжать расти. Поэтому в этих условиях по мере замедления биосинтеза производят коррекцию объёма газовых пузырьков в культуральной жидкости до тех пор, пока в аппарате не установится стационарная концентрация биомассы. Она будет соответствовать примерно 50г\л, а объём газовых пузырьков - 10%. Пененее среды в данном случае также имеет места.
Второй пример приведён для случая, когда гидролизат (исходный) подвергается концентрирование путём его выпаривания или для случая выращивания пищевых дрожжей на чистых сахарах с целью снижения объёма сточных вод в данном производстве.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет бесдополнительных затрат (использования механических, химических и иных пеногасителя значительно снизить затраты на пенопогашенее без нарушения нормального прохождения микробиосинтеза.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОНЯТИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
Поскольку в биологической литературе до сих пор многие понятия и термины часто истолковываются произвольно или вообще не определяются, мы решили попытаться дать определения основным понятиям, которые будут употребляться в данной работе и внести их из основного текста. Это, на наш взгляд, облегчит чтение настоящей работы и внесёт единообразие в терминологию. Разумеется, наши определения не претендуют на исчерпывающую полноту и строгость. Скорее всего, они отражают в некоторой степени нашу точку зрения на сущность того или иного явления или процесса. И, вполне вероятно, эта точка зрения на сущность того или иного явления или процесса. И, вполне вероятно, эта точка зрения в какой-то степени может быть ошибочной или недостаточно полно отражать действительность.
Хемосинтез - биологический процесс, в основе которого лежит система реакций окисления неорганического вещества, сопряжённая с реакциями образования соединений с богатыми энергией связями (СБЭС), идущими на восстановление углекислоты и другие процессы метаболизма, требующие энергетических затрат.
Химо синтетическая активность ХСА клетки или популяции клеток есть количество неорганического вещества, служащего источником энергии или углекислоты используемые единицей биомассы в единицу времени.
Биосинтетическая активность БСА клетки или популяции клеток есть скорость превращения компонентов среды в функциональные, структурные, запасные и другие компоненты клетки. К последним, в частности, можно отнести соединения синтезируемые в клетке и затем выходящие из неё. Очевидно, чем больше значение данной величины, тем активнее клетка или популяция.
Цепь переноса электронов ЦПЭ есть последовательность окислительно-восстановительных реакций, у которой первым компонентом является окисляемое вещество - донор электронов - а конечным - кислород или другое вещество - конечный акцептор электронов.
Сопряженное окисление есть такой процесс переноса электрона по ЦПЭ, при котором всегда образуются СБЭС за счёт высвобождаемой энергии донора электронов. При этом чем больше энергии запасается в СБЭС, тем эффективнее процесс и выше хемо и биосинтетические активности клеток. Разумеется, при этом все необходимые условия должны быть соблюдены.
Холостое окисление есть такой процесс переноса электрона по ЦПЭ, при котором энергия донора электронов не ижёт на образование СБЭС. Эффективность такого окисления для биологической системы, в смысле биосинтеза, минимальная.
Гидрогиназная активность клетки или популяции клеток есть количество водорода, используемого единицей биомассы в единицу времени. Эта величина в некоторой степени может также характеризовать и ХСА, в частности - энергетическую сторону процесса.
Карбаксилазная активность клетки или клеток есть количество двуокиси углерода, используемое единицей биомассы в единицу времени и есть суммарное использование СО2 внутриклеточными процессами. Эта величина полностью коррелирует с БСА, так как синтез всех основных компонентов клетки идёт только при наличии источника углерода и если все остальные условия соблюдены.
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
Авторы: Воронин Г.И., Золотухин Н.В.
СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ ПОД ДАВЛЕНИЕМ
Изобретение относится к технической микробиологии, к области интенсификации роста микроорганизмов с газовым питанием.
Известен способ выращивания водородных бактерий в автотрофных условиях, когда Н2, О2 и СО2 подаются в реактор-ферментер под давлением, близким к атмосферному \1968, 1969\.
Недостатком этого способа является низкая скорость процесса синтеза биомассы бактериями из-за плохой растворимости водорода и кислорода и низкой скорости диффузии этих газов и клеткам. Этот недостаток лишь частично устраняется интенсивным перемешиванием культуры и усиленным барботированием её смесью указанных газов. При таком режиме обеспечения газами растущих бактерий активный рост культуры сохраняется при 5-7 г биомассы на 1л среды \по сухому весу биомассы\. Дальнейшее увеличение концентрации и интенсификации перемешивания культуры приводит к значительным затратам энергии, не снимает диффузионных барьеров для газов, вызывает сильное пенообразование с одновременным, резким падением скорости роста бактерий.
Целью предлагаемого изобретения является разработка способа выращивания водородных бактерий при высоких рабочих концентрациях биомассы в реакторе \ 10-80 г сухой биомассы на литр среды\ с сохранением максимальной активности \биосинтетической\ клеток. Достижение этой цели даст возможность значительно уменьшить габариты установок и повысить выход биомассы с единицы объёма установки.
Поставленная цель достигается следующим образом. Активные бактерии \посевной материал\ помещаются в установку с минеральной, стерильной средой. В среду с бактериями вводят датчики величины Н2:О2\ а.с. 27650, кл. 42. 4, 16\ и датчик на растворённую СО2. Реактор-ферментер герметизируется, а воздух в нём заменяется на смесь Н2:О2:СО2, например, при помощи вакуумного насоса. Так, при исходной концентрации биомассы культуры.
1 г\л, газовая фаза реактора заменяется на смесь, состоящую из 70%Н2, 20%О2 и 10%СО2. До тех пор, пока культура не достигнет логарифмического роста, данный газовый состав поддерживается при помощи датчиков на растворённые газы при давлении, равном атмосферному. После перехода культуры в логарифмическую фазу, корректируют концентрацию минеральных солей до исходных значений, а затем повышают давление в реакторе. Так как количество растворённых газов в жидкости пропорционально давлению над жидкостью, то увеличение давления, например, в 5 раз увеличит и концентрацию всех газов примерно в 5 раз. Но увеличение концентрации О2 даже на 5% против оптимального при атмосферном давлении \20%\ резко снижает скорость роста бактерий, т.к. избыточные концентрации О2 даже на 5% против оптимального при атмосферном давлении \20%\ резко снижает скорость роста бактерий, т.к. избыточные концентрации О2 оказывают отравляющее действие на клетки. Во избежание вредного действия кислорода на клетки с повышением давления в реакторе прямо пропорционально уменьшают количество кислорода в установке. Это в некоторой степени касается и СО2, увеличение концентрации которой в среде может косвенно повлиять на рост путём снижения рН культуры. Поэтому её количество в газовой фазе при атмосферном давлении можно менять от 10 до 30%, и соответственно уменьшать при повышении давления, увеличение которого производят за счёт водорода. Последний является наиболее трудно растворим и "безвредным" для бактерий.
По мере дальнейшего роста концентрации бактерий, периодически корректируют концентрации минеральных компонентов, поддерживая их на уровнях, соответствующих логарифмическому росту клеток. Остальные условия выращивания сохраняются такими же, которые необходимы для роста бактерий при атмосферном давлении \Т=30-350, рН = 7,0 + 0,2.
По достижению концентрации биомассы 10 г\л производят новую коррекцию давления и количеств газов в реакторе. Давление увеличивают до 3 атм, а количество газов в реакторе. Давление увеличивают до 3 атм, а количество О2 и СО2 в реакторе делают таким, которое обеспечивает их объём при атмосферном давлении 20 и 10% на 1г сухой биомассы соответственно. Это условие необходимо также выполнять и при следующих увеличениях давления.
Непрерывное увеличение концентрации биомассы в реакторе, очевидно, происходит при постоянно убывающих количествах минеральных компонентов. Для того, чтобы эти изменения не снижали скорость роста бактерий, необходимо производить периодический контроль и коррекция концентраций данных компонентов, путём введения необходимых их количеств в реактор под давлением.
По достижению заданной концентрации биомассы бактерий в установке, процесс прекращают или переводят на режим непрерывного выращивания. Последний обеспечивается путём поддерживания на определённых уровнях давления, концентраций газовых и минеральных компонентов в реакторе. Суспензия бактерий из реактора в виде конечного продукта выходит при этом самотёком.
Газы в реактор подаются под давлением из газольдэров, давление которых значительно \ в десятки раз\ превышает давление в реакторе. Это необходимо для обеспечения быстрой корректировки концентраций газов и восполнения их расхода в процессе хемосинтеза. Регулирование концентраций и скоростей поступления газов в реактор при этом осуществляется датчиками растворенных газов.
Режим перемешивания культуры при росте её под давлением остаётся таким же, как и при выращивании бактерий при атмосферном давлении, т.е. дополнительных затрат энергии на перемешивания по предлагаемому способу не требуется.
Пример. Бактерии выращиваются в условиях непрерывной культуры. Рабочий объём установки равен 1 м3. Концентрация бактерий в установке - 25 г\давление - 4атм. Время генерации \ время удвоения биомассы составляет 2 часа. Следовательно, для поддержания культуры в активном состоянии при данных условиях из установки необходимо отбирать 12,5 кг биомассы в час. Учитывая то, что концентрация белка в биомассе водородных бактерий составляет 70% от общего веса сухой биомассы, производительность установки составляет 210 кг белка в сутки.
Формула изобретения
Способ выращивания водородных бактерий под давлением, в условиях, например, проточного их культивирования в автотрофных условиях, отличающийся тем, что с целью интенсификации процесса при высоких рабочих концентрациях биомассы \более 10г сухой биомассы в 1л среды\ в постоянном режиме перемешивания, выращивание бактерий ведут под давлением, превосходящим в несколько раз атмосферное, которое создаётся за счёт водорода.
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
Авторы: Воронин Г.И., Золотухин Н.В.
СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ ПОД ДАВЛЕНИЕМ
Изобретение относится к технической микробиологии, к области интенсификации роста микроорганизмов с газовым питанием. Известен способ выращивания водородных бактерий в автотрофных условиях, когда Н2 , О2 и СО2 подаются в реактор - ферментер под давлением, близким к атмосферному \1966;1969\.
Недостактом этого способа является низкая скорость процесса синтеза биомассы бактериями из-за плохой растворимости водорода и кислорода и низкой скорости диффузии этих газов к клеткам. Этот недостаток лишь частично устраняется интенсивным перемешиванием культуры и усиленным барботированием её смесью указанных газов. При таком режиме обеспечения газами растущих бактерий активный рост культуры сохраняется при 5-7 г биомассы на 1л среды \по сухому весу биомассы\. Дальнейшее увеличение концентрации и интенсификации перемешивания культуры приводит к значительным затратам энергии, не снимает диффузионных барьеров для газов, вызывает сильное пенообразование с одновременным, резким падением скорости роста бактерий.
Целью предлагаемого изобретения является разработка способа выращивания водородных бактерий при высоких рабочих концентрациях биомассы в реакторе \10-20 г сухой биомассы на литр среды\ с сохранением максимальной активности \биосинтетической\ клеток. Достижение этой цели даст возможность значительно уменьшить габариты установок и повысить выход биомассы с единицы объёма установки.
Поставленная цель достигается следующим образом. Активные бактерии \посевной материал\ помещаются в установку с минеральной, стерильной средой. В среду с бактериями вводят датчики величины Н2:О2 \а.с. 27650, кл.42, 4.16\ и датчик на растворённую СО2. Реактор-ферментер герметизируется, а воздух в нём заменяется на смесь Н2:О2:СО2, например, при помощи вакуумного насоса. Так, при исходной концентрации биомассы культуры 1г\л, газовая фаза реактора заменяется на смесь, состоящую из 70%Н2, 20%О2 и 10%СО2. До тех пор, пока культура не достигнет логарифмического роста, данный газовый состав поддерживается при помощи датчиков на растворённые газы при давлении, равном атмосферному. После перехода культуры в логарифмическую фазу, корректируют концентрацию минеральных солей до исходных значений, а затем повышают давление в реакторе в два раза. Так как количество растворённых газов в жидкости пропорционально давлению над жидкостью, то увеличение давления, например, в 5 раз увеличит и концентрацию всех газов примерно в 5 раз. Но увеличение концентрации О2 даже на 5% против оптимального при атмосферном давлении 20% резко снижает скорость роста бактерий, т.к. избыточные концентрации О2 оказывают отравляющее действие на клетки. Во избежание вредного действия кислорода на клетки с повышением давления в реакторе прямо пропорционально уменьшают количество кислорода в установке. Это в некоторой степени касается и СО2, увеличение концентрации которой в среде может косвенно повлиять на рост путём снижения рН культуры. Поэтому её количество в газовой фазе при атмосферном давлении можно менять от 10 до 30%, и соответственно уменьшать при повышении давления, увеличение которого производят за счёт водорода. Последний является наиболее трудно растворим и "безвредным" для бактерий.
По мере дальнейшего роста концентрации бактерий, периодически корректируют концентрации минеральных компонентов, поддерживая их на уровнях, соответствующих логарифмическому росту клеток. Остальные условия выращивания сохраняются такими же, которые необходимы для роста бактерий при атмосферном давлении \Т=30-350, рН=7,0+0,2.
По достижению концентрации биомассы 10г\л производят новую коррекцию давления и количеств газов в реакторе. Давление увеличивают до 3 атм, а количество О2 и СО2 в реакторе делают таким, которое обеспечивает их объём при атмосферном давлении 20 и 10% на 1г сухой биомассы соответственно. Это условие необходимо также выполнять и при последующих увеличениях давления.
Непрерывное увеличение концентрации биомассы в реакторе, очевидно, происходит при постоянно убывающих количествах минеральных компонентов. Для того, чтобы эти изменения не снижали скорость роста бактерий, необходимо производить периодический контроль и коррекция концентраций данных компонентов, путём введения необходимых их количеств в реактор под давлением.
По достижению заданной концентрации биомассы бактерий в установке, процесс прекращают или переводят на режим непрерывного выращивания. Последний обеспечивается путём поддержания на определённых уровнях давления, концентраций газовых и минеральных компонентов в реакторе. Суспензия бактерий из реактора в виде конечного продукта выходит при этом самотёком.
Газа в реактор подаются под давлением из газгольдеров, давление которых значительно \в десятки раз\ превышает давление в реакторе. Это необходимо для обеспечения быстрой корректировки концентраций газов и восполнения их расхода в процессе хемосинтеза. Регулирование концентраций и скоростей поступления газов в реактор при этом осуществляется датчиками растворённых газов.
Режим перемешивания культуры при росте её под давлением остаётся таким же, как и при выращивании бактерий при атмосферном давлении, т.е. дополнительных затрат энергии на перемешивания по предлагаемому способу не требуется.
Например. Бактерии выращиваются в условиях непрерывной культуры. Рабочий объём установки равен 1 м3. Концентрация бактерий в установке - 25г\давление - 4 атм. Время генерации \время удвоения биомассы составляет 2 часа\. Следовательно, для поддержания культуры в активном состоянии при данных условиях из установки необходимо отбирать 12,5 кг биомассы в час. Учитывая то, что концентрация белка в биомассе водородных бактерий составляет 70% от общего веса сухой биомассы, производительность установки составляет 210 кг белка в сутки.
Формула изобретения
Способ выращивания водородных бактерий под давлением, в условиях, например, проточного их культивирования в автотрофных условиях, отличающийся тем, что с целью интенсификации процесса при высоких рабочих концентрациях биомассы \более 10 г сухой биомассы в 1л среды\ и постоянном режиме перемешивания, выращивания бактерий ведут под давлением, превосходящим в несколько раз атмосферное, которое создаётся за счёт водорода.
УПРАВЛЕНИЕ МИКРОБИОСИНТЕЗОМ - ОДНА ИЗ ОСНОВНЫХ ПРОБЛЕМ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Сознательное управление процессами жизнедеятельности является основной проблемой биологии. Решение её даст значительный эффект не только в области теоретических исследований живого, но и в практической деятельности человека. На большую значимость работ в данном направлении говорят многочисленные публикации работ по результатам исследований различных биологических процессов на всех уровнях организации живой материи. Уже имеются определённые положительные результаты в решении указанной проблемы, например, в области генетических исследований, в результате которых выявлены некоторые механизмы в регуляции синтеза отдельных клеточных компонентов, а также получены различные штаммы микроорганизмов и сорта и виды растений и животных, по своим свойствам значительно превосходящие своих предшественников.
В области изучения микробов также имеются известные успехи, хотя ряд основных проблем продолжает оставаться не решёнными. К ним, в частности, относятся: 1) стабилизация во времени скорости роста микробной популяции, 2) стабилизация качества конечного продукта, 3) отсутствие методов "тонкой" и "мягкой" регуляции отдельных процессов и реакций, обеспечивающих синтезы наиболее дефицитных биологически активных соединений \высококачественного белка, отдельных незаменимых аминокислот, витаминов и др.\ 4) разработка простых и надёжных методов непрерывного контроля микробиологического процесса и полной его автоматизации и др.
По мнению ведущих исследователей процессов жизнедеятельности, основанных на тщательном анализе экспериментального материала, механизмы синтезов отдельных клеточных компонентов, механизмы регуляции скоростей отдельных процессов и реакций внутри клетки, молекулярная и надмолекулярная организация различных структур живой клетки и т.п., имеют универсальный характер на всех уровнях организации живой материи. Данный универсализм в значительной степени облегчает решение проблемы управления процессами жизнедеятельности, в частности, у различных видов микроорганизмов. И задача здесь сводится к разработке способов регулирования не только совокупности процессов и реакций, но и отдельных, "узловых" реакций, имеющих место в нормально растущем одноклеточном организме. Их регулирование, например через температуру, концентрацию ионов водорода, оптическую плотность, через периодический анализ биомассы и культуральной жидкости, особого эффекта не даёт. На это указывают многочисленные экспериментальные работы. Поэтому регулирование жизнедеятельности микробной клетки нуждается в новых подходах, в новых принципах и методах. В общем они должны сводится к контролю работы механизмов внутриклеточной регуляции, выяснению их природы, их взаимозависимости и взаимовлияния и в конечном итоге - к сознательному управлению жизнедеятельностью микробной популяции. Решение этих задач даст возможность значительно повысить эффективность технологии получения различных продуктов микробного происхождения, заданного качества и при высоких скоростях процесса их получения.
Работы в данном направлении были начаты в институте ВНИИбиотехника, были получены конкретные новые результаты по зависимости и взаимовлиянию основных внутриклеточных процессов, были разработаны ряд способов повышения эффективности процесса роста микробной популяции при помощи простых и надёжных методов без привлечения сложной и дорогостоящей аппаратуры. Но по ряду причин эти работы были приостановлены, а их результаты в настоящее время находятся в обработке.
Результаты наших работ показывают, что уже сейчас можно начать создание действующей модели автоматической технологической линии, основанной на принципе "живая клетка - автомат", т.е. на принципе самонастраивающихся систем. Имеется также основа для создания технологии получения высококачественного белка в условиях стабильности процесса, его скорости и качества продукта.
Учитывая важность и перспективность работ по регулированию микробиологических процессов со штатом 12-15 человек и годовым бюджетом 50-75 тыс.руб. В задачу данной лаборатории будет входить разработка способов управления жизнедеятельностью микробной популяции, создание действующих моделей с максимальной автоматизацией процесса её роста и синтезов конкретных соединений и выдача практических рекомендаций для проектных и других организаций по созданию новой техники для микробиологической промышленности, а также по усовершенствованию технологии производства микробной продуктов.
29 мая 1973г. Н.В. Золотухин
Н.В.ЗОЛОТУХИН, Э.М.ЯКУБОВ, А.В.ЮЛДАШЕВ.
К РЕШЕНИЮ ПРОБЛЕМЫ УПРАВЛЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫМ МИКРОБИОСИНТЕЗОМ
Микробиологический синтез является одним из перспективных способов промышленного получения важнейших продуктов различного назначения. Это- кормовой и пищевой белки, антибиотики, витамины, незаменимые аминокислоты и т.п. В нашей стране действуют десятки заводов и продолжают проектироваться и строиться новые комплексы по переработке промышленных и сельскохозяйственных отходов в высококачественные физиологически активные соединения на основе микробиосинтеза.
Не смотря на то, что микробиологическая промышленность зародилась в СССР ещё в 30-е годы нынешнего столетия, а в 60-е годы она получила большие возможности для интенсивного своего развития, перед ней продолжают остро стоять ряд нерешённых проблем и задач. Одной из центральных проблем в микробиологической промышленности стоит проблема управления микробио синтезом на стадии непрерывного воспроизводства микробной массы (дрожжей, бактерий и др.) или получения продуктов их жизнедеятельности (витаминов, аминокислоты, антибиотиков и т.д.).
Как показали многолетние теоретические и экспериментальные исследования различными институтами и лабораториями, решена проблема управления микробио синтезом с целью значительного повышения его эффективности тесно сопряжено с решениями других крупных задач. Таковыми, на наш взгляд, являются:
- разработка эффективной биотехнологии на основе методов молекулярной и физико-химической биологии, математического и физического моделирования;
-разработка теории процессов жизнедеятельности одноклеточных организмов на основе системно-кибернетического подхода и анализа;
-разработка и создание АСУ биотехнологическими процессами.
По-видимому, положительные результаты, полученные при решении указанных задач, могут явиться основой для повышения эффективности микробио индустрии. В данном направлении уже имеется определённый теоретический и практический опыт \1-8\. Но, тем не менее, наряду с биотехнологическими задачами, всё ещё продолжает стоять проблема разработки оптимальной конструкции аппарата для выращивания микроорганизмов - микробио реактора или ферментера.
Известно, что в лабораторных или промышленных условиях при выращивании микроорганизмов на жидких питательных средах в 1 мл среды находится десятки и сотни миллионов клеток. Для нормального их функционирования необходимо чтобы в околоклеточном пространстве постоянно находились все питательные компоненты в нужных количествах и соотношениях. В этом плане удобными являются гидролизаты растительного сырья . В этих средах после соответствующего их обогащения практически содержатся все компоненты питания микроорганизмов, например дрожжей, кроме молекулярного кислорода. Причём, данные компоненты легко растворимы в воде. Поэтому их концентрации в микробной культуре одинаковы во всех точках объёма питательной среды и, следовательно, одинаковы доступны для всех микробных клеток. Кислород же, выполняющий важнейшую роль в энергетике любой аэробной клетки, имеет очень низкую растворимость в воде. Поэтому его нужно принудительно доставлять к клеткам. В подавляющем большинстве действующих и предлагаемых микробио реакторах, эта задача решается при помощи активного перемешивания жидкой и газовой фаз. Это, разумеется, требует определённых энергетических затрат. Например, если биологический эффект от интенсивности перемешивания, например с использованием механических мешалок, возрастает линейно на несколько процентов, то затраты энергии при этом могут увеличиваться на несколько процентов. Кроме того, интенсивное перемешивание микробных культур значительно снижает полезный объём аппарата и вызывает обильной и стойкое пененее, отрицательно влияющего на работу технологического оборудования. Это явление имеет место в гидролизно-дрожжевом производстве, в котором 2\3 общего объёма аппарата приходится на пенную фазу и лишь 1\3 является полезной т.е. занята рабочей средой.
На базе Янгиюлбьского биохимического завода мы проводили исследования дрожжевого производства с целью разработки и создания системы управления микробиосинтезом. Было установлено, система аэрации дрожжевой культуры на данном заводе и родственных ему предприятиях имеет существенные недостатки. Во-первых, значительная часть дрожжей не обеспечивается кислородом из-за конструктивных особенностей системы воздухораспределения. Воздух подаётся в несколько точек рабочего объёма аппарата на высоте около 1м от днища. Во-вторых, проектом предусмотрен значительный расход воздуха (около 10000 м3\час), вызывающий обильное пенениее среды, что приводит к дестабилизации микробиосинтеза.
Анализ работ по решению задачи равномерного обеспечения кислородом растущих микробных клеток в том или ином объёме питательной среды показывает, что авторы в данном случае преследуют одну цель - как можно более интенсивно перемешивать жидкую культуру микроорганизмов с надеждой получить желаемый биологический эффект. Эти разработки имеют широкое распространение и они, как правило, приводят к усложнению конструкции аппарата, повышению его метало и энергоёмкости и, как следствие, снижению его надёжности в работе. Учитывая же то, что микробные клетки даже при лёгком встряхивании их жидкой культуры легко переходят во взвешенное состояние, интенсивное перемешивание, очевидно, для поддержания такого состояния не является необходимым. Это во-первых.
Во-вторых, для управления ростом микробных клеток, находящихся в водной среде с легко растворимыми питательными компонентами необходимо иметь эффективный и надёжный способ доставки труднорастворимых и быстро поглощаемых клетками компонентов в любую точку рабочего объёма биореактора, в нужном количестве и с необходимой скоростью. Именно решению этой задачи и посвящена данная работа, применительно к производству дрожжей из гидролизатов растительного сырья и минеральных солей.
В производстве дрожжей из гидролизатов растительного сырья самым узким местом является обеспечение растущих клеток молекулярным кислородом. Растворимость данного газа в воде при физиологических условиях крайне низка (около 20-30 мл на 1 л среды). Потребление же его микробными клетками достаточно велико (около 1 л в час на 1 г сухих клеток). Следовательно, с учётом этих фактов, решение задачи непрерывного обеспечения растущих клеток кислородом в нужном количестве, по-видимому, можно достигнуть за счёт равномерного распределения этого газа по горизонтальному сечению объёма рабочей среды и скоростью его продвижения по вертикали.
К ВОПРОСУ О ПРИРОДЕ САМОРЕГУЛИРОВАНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ФУНКЦИОНИРУЮЩЕЙ КЛЕТКЕ
Н.В. Золотухин
Исследования саморегуляции различных реакций и процессов в интактной, функционирующей клетке имеют первостепенное значение для понимания различных сторон организации живых объектов. При этом особенно ценными, очевидно, являются результаты, полученные методами, которые не взаимодействуют с объектом исследования, но которые дают непрерывную информацию о течении основных процессов жизнедеятельности в различных ситуациях.
Получение непрерывной информации о ходе основных процессов, обеспечивающих метаболизм клетки, стало возможным в связи с тем, что для этих целей был найден весьма удачный объект - одноклеточные организмы, использующие для своей жизнедеятельности самые элементарные природные вещества (Н2,О2, СО2, NH3 и др.). Для данного объекта удалось разработать методы непрерывного получения информации о поглощении клетками субстратов для процессов биоэнергетики и биосинтеза. Данные методы при этом являются индиферетными по отношению к самой клетке.
Экспериментально нами установлено, что связи между энергетическими и синтетическими процессами в функционирующей клетке нежесткие и могут легко разрываться. Это происходит при соответствующих мягких воздействиях как на биосинтез, так и на биоэнергетику клетки. Например, повышение концентрации конечного акцентора электронов в дыхательной цепи (О2) до "критического" уровня полностью останавливает биосинтез. При этом скорость использования энергетического субстрата и кислорода значительно снижается. Но нулевых значений не принимает.
Уменьшение же концентрации источников углерода или азота в среде ниже "оптимальных" значений резко снижает скорости биосинтеза клеточных компонентов. Скорость биоэнергетических процессов также снижается, но в меньшей степени. Как в первом, так и во втором случаях процессы являются обратимыми. Предполагается, что в первом примере включается механизм, отвлекающий свободную энергию субстрата от системы, аккумулирующей её в унифицированные биологические формы. Во втором же примере в качестве автоматического регулятора связей между биоэнергетической и биосинтетической системами, вероятно, служит дыхательный контроль. Обсуждаются также и возможные альтернативы с учётом физико-химических свойств субстратов и внутренней среды клетки.
19.10.1975г. Н. Золотухин
О СВЯЗИ МЕЖДУ СКОРОСТЬЮ РОСТА ДРОЖЖЕЙ И ИНТЕНСИВНОСТЬЮ ПРОЦЕССА ПЕНООБРАЗОВАНИЯ
Современное биохимическое (микробиологическое) производство основано на использовании различных видов микроорганизмов и органического и неорганического сырья той или иной природы. Данное сырьё служит исходными элементами питания непрерывно растущих микробных клеток. Эти элементы, проникая в микробные клетки, многочисленные превращения, осуществляемые многочисленными внутриклеточными ферментами. Конечными продуктами данных превращений являются белки, нуклеиновые и органические кислоты, липиды, полисахара и т.д. Кроме того, из клеток в процессе их жизнедеятельности выходят углекислый газ, вода и в определённых условиях - различные органические вещества. Следовательно, в технологической линии производства кормового белка, центральным звеном является микробиосинтез, т.е. рост и размножение микробных клеток за счёт непрерывного поглощения ими из окружающей среды элементов питания и превращения их в клеточные компоненты.
Уже давно, десятилетия и столетия микроорганизмы успешно выращивают и с их помощью получают желаемые продукты. Однако, при этом микроорганизмы не всегда "работают" на полную"мощность", т.е. не всегда удаётся получать максимум того, чем располагает генетическая конституция продуцентов, т.к. выращивание микроорганизмов зачастую производят в случайно найденных условиях, которые в подавляющем большинстве не всегда могут быть оптимальными. К тому же эти условия микроорганизм сам изменяет без воли, а часто и без ведома экспериментатора. Только после многолетних работ крупных коллективов, ощупью находятся "оптимальные" условия, лишь иногда приближающиеся к действительно оптимальным.
Как показывают многочисленные работы разных авторов уже сейчас появляется принципиальная возможность вести микробиосинтез на оптимальном уровне автоматически, по команде самой культуры и практически в течение неограниченного времени. В случае получения биомассы как таковой уже можно получать её с заданными соотношением биополимеров, ферментов, витаминов и т.д., т.е сознательно обеспечивать заданное качество конечного продукта. Разумеется, задача эта не из простых и для своего решения она требует широкого круга исследований биохимии и физиологии микроорганизмов с использованием биологических, химических, физико-химических и математических методов исследований. Особую роль при этом, очевидно, играют методы контроля состояния непрерывно растущей микробной популяции.
Уже сейчас имеются технические возможности контроля многих параметров в культурах микроорганизмов: существуют датчики рН, Еh, рО2, компонентов среды, датчики величин параметров, интегрально описывающих культуру - интенсивность дыхания (по поглощению кислорода), датчики цитологической картины - состояние протопласта, включений, органелл клетки и т.д. Все эти датчики уже сейчас могут быть включены в систему биореакторов (ферментов) и управляющих машин и любые параметры в принципе могут поддерживаться на заданном уровне. Но, к сожалению, эта техника интенсивно разрабатывается для химической промышленности, но не по заказу микробиотехнологии, хотя последняя уже сейчас может взять многое в готовом виде.
МИКРООРГАНИЗМЫ И СРЕДА
Метаболизм микроорганизмов известен достаточно хорошо, а за последние 10-15 лет была установлена универсальность основных реакций и процессов практически для всех форм жизни. Тем не менее, поведение целых клеток, их популяций (рост микробы в тех или иных объёмах среды) требуют специального изучения именно этого, популяционного уровня. Условия культивирования, оптимальные для активности тех или иных функций клетки, нельзя определить на основе только химических и энзимологических данных. Необходимо выявлять связи между внутриклеточными процессами и условиями среды, между внешним "видом" микробиосинтеза и значениями параметров внешних факторов, между концентрациями биомассы и элементов питания клеток.
Например, при выращивании микроорганизмов в больших ёмкостях клетки временами попадают в зоны недостатка кислорода, в зоны недостатка кислорода, в которых процессы, связанные с его потреблением, прекращаются. Это приводит к остановке микробиосинтеза и к снижению общей активности микробной популяции. Низкие же значения рН, которые обычно задаются в условиях нестерильного выращивания дрожжей для подавления бактериальной инфекциями, создают условия появления в среде ионов тяжёлых металлов, которые могут значительно подавлять рост микроорганизмов из-за своей токсичности (3). При нейтральных значениях рН ионы указанных металлов образуют комплексы с органическими веществами и выпадают в осадок. Их токсичность при этом нейтрализуется.
По данным биохимического и других анализов в активно растущих клетках ежесекундно совершаются тысячи и миллионы элементарных и сложных реакций и процессов, которые могут прямо или косвенно зависеть от концентраций компонентов питательной среды. При этом они могут затормаживаться не только низкими, но и высокими концентрациями элементов питания клеток. Так, например, недостаток источника азота (аммиака) в среде не только замедляет рост микроорганизмов, их размножение, но и снижает содержание в них аминокислот, белков и нуклеиновых кислот, за счёт активации синтеза липидов. Клетки при этом могут значительно облегчаться и всплывать в верхние слои среды -с соответствующим вспениванием культуры.
Недостаток или отсутствие ионов железа в среде, резко снижает количество метаболически доступной энергии в клетке и выход биомассы с соответствующим ухудшением внешнего вида процесса (4). Для аэробного микробиосинтеза, например, выращивание дрожжей на гидролизатах растительного сырья, при прочих равных условиях, исключительное значение имеет наличие кислорода в околоклеточном пространстве. Отсутствие его в клетке, как правило останавливает все ростовые процессы, связанные с потреблением энергии. Это может привести к отмиранию клеток с последующей их деструкцией. Недостаток же кислорода в среде резко снижает синтез белковых соединений в клетке и индуцирует синтез жироподобных соединений. Клетки при этом замедляют свой рост, становятся легче воды и всплывают (флотируются) на поверхность, образуя пенную фазу. Очевидно, что недостаток основного субстрата в среде, например, сахаров, прямо сказывается не только на скорости роста микроорганизмов, но и на качественном их составе. Это объясняется тем, что сахара для аэробно растущих микроорганизмов служат одновременно источником энергии, конструктивными углеродом, кислородом и водородом. Поэтому снижение потоков энергии и конструктивных элементов в соответствующие реакции и процессы скажется не только на их интенсивности, но и на количественном соотношении компонентов синтезируемой биомассы. На основании вышеизложенного можно заключить, что микробиосинтез независимо от объёма, в котором он протекает, представляет собой многопараметрический биологический процесс, скорость которого зависит не только от наличия в среде элементов питания клеток, но и от значений их концентраций в среде. Внешний же вид процесса не однозначно определяется тем или иным параметром среды.
Скорость роста, перемешивание и пененее микробных культур
Как указывалось выше, рост микроорганизмов осуществляется за счёт непрерывного поглощения клетками элементов питания. Последние на практике в основном представляют сложные водные растворы органических и неорганических соединений. При этом органические вещества, как правило, играют роль основного "строительного" материала в процессе увеличения веса тела клеток. Другие же элементы, такие как ионы водорода калия, кальция, хлора и др., необязательно входят в структуру клетки, но являются обязательными в таких процессах как осмос, создание потенциалов на мембранах при трансформации энергии электронов субстрата в энергию химических связей аденозинтрифосфата и т.п. Но тем не менее, как конструктивные, так и энергетические процессы при микробиосинтезе совершаются внутри клеток. Следовательно, скорость микробиосинтеза в конечном итоге определяется не столько значениями внешних факторов среды, а наличными концентрациями питательных элементов, их абсолютными значениями внутри клетки. В научной и технической литературе особое внимание уделяется вопросам оптимизации микробиосинтеза. При этом рассматриваются и решаются такие задачи как:
- оптимизация состава питательной среды (5);
- создание универсального аппарата для культивирования микроорганизмов (6);
- влияние леминизирующих и ингибирующих факторов на микробиосинтез (7);
- процесс пенообразования и способы пеногашения при выращивании микроорганизмов.
и другие задачи, связанные с аппаратурным оформлением процесса и методами управления микробиосинтезом. В отечественной и зарубежной литературе в последние 10 лет много внимания уделяется вопросам пенообразования и пеногашения при выращивании микроорганизмов с использованием тех или иных способов перемешивания микробных культур. При этом предлагаются следующие технические решения:
- различные конструкции механических пеногасителей, укрепляемых на валу перемешивающих устройств (8)
- применение химических пеногасителей (9);
- использование физико-химических методов (10).
Результаты первых двух направлений работ по пеногашению применяются на стадии выращивания микроорганизмов. При этом отмечается, что в большинстве случаев высокие гасящие свойства способов сопряжены либо с большими энергетическими расходами, либо с высокими финансовыми затратами. К тому же использование различных химических пеногасителей не всегда приемлемо из-за их ингибирующего действия на рост микроорганизмов. Физико - химические методы пеногашения используются на стадии выделения биомассы из культуральной жидкости. Поэтому они не представляют особого интереса т.к. они не связаны с процессом культивирования микроорганизмов. Наибольший интерес представляют, на наш взгляд, лишь те методы выращивания и пеногашения, которые не влияют на скорость роста микроорганизмов. В связи с этим нами были проанализированы причины пененея тех или иных микробных культур в лабораторных и производственных условиях. Многочисленные литературные источники в большинстве случаев не отлагают пененея микробных культур. Это, по-видимому, можно объяснить тем, что в экспериментах исследователи используют среды, которые либо не обладают свойствами пененея при тех или иных свойствах аэрации, либо эти свойства у них проявляются очень слабо. Тем не менее, почти все способы выращивания микроорганизмов, рекомендованные к использованию в промышленности, обладают одним общим недостатком - их реализация производственных условиях сопряжена с пенообразованием. Этим и объясняется возникновение в технической литературе целого направления по разработке способов и механических устройств, по пено погашению на стадии выращивания микроорганизмов. Изыскиваются разлчичные химические вещества, к которым микробные клетки индиферентны, но которые в свою очередь обладают высокими пено гасящими свойствами. В США (11) и Японии (12) разработаны способы регулирования пенообразования во время роста микроорганизмов в ферментере с перемешиванием питательной среды путём использования химических полимеров с высоким молекулярным весом. Кроме того, американские исследователи в качестве пеногасителей предлагают использовать талловые (нефтонные) масла в смеси с минеральными и тростниковыми маслами. Предлагаемые способы пеногашения, как считают сами авторы, достаточно эффективны и не влияют на скорость роста микроорганизмов. Следовательно, интенсивность процесса пенообразования при культивировании микроорганизмов и скорость роста микробных клеток являются независимыми величинами. При этом рост микроорганизмов полностью определяется свойствами и составом питательной среды, а интенсивность процесса пенообразования - способами доставки слабо растворимого питательного компонента - кислорода (для аэробов) к растущим клеткам и свойствами самой питательной среды. При этом, как показывает практика, среды используемых питательных сред в производстве кормовых дрожжей среда из гидролизатов растительного сырья без дрожжей вспенивается даже при слабой аэрации. В связи с тем, что существующая технология производства кормовых дрожжей на гидролизных средах основана на создании мощной пенкой фазы в аппарате, нами были проведены эксперименты по выявлению возможностей выращивания дрожжей не в пенной, а в жидкой фазе. Опыты проводили в аппарате ёмкостью 1000 л. Культуры дрожжей (ЯЮ-6 и ЯЮ-11) получали из микробиологической лаборатории Янгиюльского биохимического завода в виде спрессованных лепёшек. Процесс начинали в лабораторных условиях в банках на смешанной среде (раствор глюкозы + гидролизат) по методике, принятой на ЯБЗ. Наращивание биомассы проводили в течение 6-8 часов при Т=370 и рН=4,0-4,2. После этого культуру дрожжей переносили в аппарат, наполненный на 70-100л производственной (разбавленной) средой (концентрация РВ=0,45 - 0,55%), включали подачу воздуха и начинали процесс. В виду отсутствия прибора по замеру расхода воздуха, регуляцию подачи воздуха осуществляли визуально до появления лёгкой пены на поверхности среды. На графике показана типичная картина увеличения биомассы дрожжей и расхода пеногасителя (сильно разбавленного горячей водой). Пеногаситель при этом брали из заводской ёмкости. Из данных графика следует, что после перенесения дрожжей и банки их рост практически не затормозился и за 6 часов количество дрожжей с 400г увеличилось 10 кг. Отсюда следует, что за данный промежуток времени произошло 4,5 генерации дрожжевых клеток. При этом наблюдали лёгкое пененее среды, которое устраняли малыми (1-2) мл добавками разбавленного пеногасителя. Следует особо подчеркнуть, что во всех случаях, когда опыты начинали с посева чистой культуры, выращенной в лабораторных условиях, дрожжи росли весьма активно. Время усвоения биомасс составляло 1,5-2,5 часа. Это указывает на то, что производственные штаммы дрожжей обладают большими потенциальными биосинтетическими возможностями, чем считается в настоящее время по регламенту, за счёт незначительных добавок пеногасителя на стадии выращивания. Возможности обеспеного культивирования дрожжей за счёт незначительных добавок пеногасителя на стадии выращивания, выявленные в проведённых экспериментах дают основу для увеличения полезного объёма дрожжерастительного аппарата в 2-3 раза. Кроме того, отсутствие пенной фазы на данной стадии упрощает последующее отделение дрожжей от культуральной жидкости. Таким образом, как по литературным, так и по нашим данным скорость роста дрожжей не зависит от процесса пенообразования. Последний же является свойством питательной среды или же следствием работы перемешивающих устройств. Эпизодическое же возникновение пены при непрерывном выращивании, вероятно, объясняется меняющимися свойствами поступающей среды.
Рост биомассы (2) и расход пеногасителя (2) в процессе культивирования дрожжей ЯЮ-6 в аппарате ёмкостью 1000 л.
Как известно, получение биологически активных с-ний путём микробиологического синтеза в промышленных условиях сопряжено с рядом трудностей, преодоление которых приведёт к повышению эффективность процесса и качества конечного продукта одной из таких трудностей является обеспечение стерильности процесса в условиях интенсивного прохождения процесса. Так, например, снижение степени загрязнения посторонней микрофлорой путём периодического снижения рН ниже оптимальных значений, повышает выход дрожжевой биомассы на 20-40% (Н.Б. Градова, А.М. Зубец, Л.Н. Шубина, 1969. Микробилогический синтез, вып. 11-12, стр.17). Кроме загрязнения посторонней микрофлоры на интенсивность микробиологического синтеза влияет доступность всех компонентов питательной среды для растущих микробных клеток. Выращивание в условиях непрерывной культуры (самый перспективный метод в настоящее время) ведётся следующим образом. Перед началом процесса реактор - ферментер стерилизуется паром или кипятком. Затем в него вносится стерильная питательная среда в виде раствора и сами микробы. После перехода на непрерывный процесс, в реактор постоянно или периодически подаются питательные компоненты в виде концентрированных растворов, т.к. в реакторе концентрации ранних компонентов постоянно уменьшаются. Поскольку питательная среда для всех м\о обязательно служат ионы фосфора, магния, железа и др., то увеличение концентраций этих ионов приводит, как правило, к образованию сложных химических комплексов, которые выпадают в виде твёрдого осадка. Выпадение в осадок компонентов питания среды приводит к лишению клеток тех или иных ингредиентов питания и тем самым снижает интенсивность процессов. Для устранении указанных недостатков нами был разработан способ выращивания микроорганизмов, обеспечивающий полную стерильность и высокую эффективность процесса. Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. После стерилизации реактора-ферментера, стерильного выяснения неконцентрированной чистой среды и посевного материала добавление питательной среды проводится следующим образом. Все жидкие компоненты предварительно стерилизуются (пеплом, ультразвуком или другими способами) и в стерильном виде подаются в реактор, например по стерильным трубам или шлангам. Все минеральные (обычно твёрдые) компоненты стерелизуюся отдельно при t до 1600. Причём, соотношение ранних компонентов берётся такие, которое соответствует логарифмической фазе роста того или иного м\о. С переходом на непрерывный процесс (вода, щёлочи или кислоты) и твёрдые компоненты подаются в реактор отдельно в таком количестве, которое обеспечивает необходимую скорость выхода конечного продукта, например, микробной массы.
Пример 1. выращивание хемоавтотрофных м\о в условиях непрерывной культуры произв. след. обр. для достижения заданной концентрации биомассы исходный объём суспензии практически не меняется, т.к. в реактор периодические подаются только смесь твёрдых компонентов питания в таком количестве, которое обеспечивает исправный рост биомассы. После достижения заданной концентрации клеток процесс переключается на непрерывный. Это означает, что восполнение объёма отображает одновременно с добавлением твёрдых компонентов производится и добавление соответствующих количеств стерильной воды. Подача в реактор стерильной воды. Подача в реактор тех или иных газовых компонентов производится через бактериальный синтез.
Пример 2. Выращивание гетеротрофных организмов, например углеводородокисляющие для данного процесса рассмотрим наиболее системную схему. Она включает в себя: а) отдельная подача углеводорода, например жидкого ; б) отдельная подача источника азота, например раствор аммиака, в) отдельная подача минеральной среды г) обеспечение клеток кислородом д) отвод газообразных продуктов.
В этом случае, как и в первом, все жидкие компоненты в том числе и вода стерилизуются отдельно и стерильно подаются в реактор в определённых количествах. Минеральные компоненты также стерилизуются в твёрдом виде и стерильном виде также подаются отдельно. Подходящие и выходящие газы проходят сквозь бактериальные фильтры. При этом объём поданных всех компонентов питания равен объёму отобранной суспензии бактерий. Способ выращивания м\о в непрерывной культуре, с целью обеспечения стерильности и высокой эффективности процесса: 1. жидкие и твёрдые компоненты питательной среды стерилизуются отдельно и также отдельно в стерильном виде добавляются в реактор с минеральной культурой. 2.Способ отличающийся от п.1 тем, что для обеспечения высокой эффективности процесса добавления компонентов среды в реактор - ферментер производится в таких количествах и соотношениях, которые обеспечивают максимальный выход необходимого продукта. Н2 бактерий являются одной из перспективных продуктов соединений, т.к. содержит высокопитательный белок. Получение высококачественной биомассы данных бактерий представляют большой практический интерес, но сопряжено с рядом технологических трудностей. Помимо трудности обеспечения автотрофного роста культуры водородных бактерий газами (Н2; О2 и СО2) в нужном соотношении, имеется также трудность управления направленности метаболизма этих м\о. В настоящее время проблема управления газовым питанием данных бактерий уже решена (Золотухиным 1970). Но по-прежнему остаётся не решённой проблема направленного биосинтеза у вида бактерий и в частности нерешенной остаётся задача получения биомассы, не содержащей ПГПК. Данное соединений не усваивается животными организмами и вызывает различные токсические действия. Кроме того, установлено, что синтез этого компонента может проходить как при условии наличия необходимых питательных компонентов, там в дистилированной воде в присутствии Н2; О2 и СО2.. Имеются данные, которые говорят о том, что в период экспоненциального роста Н бактерий в их биомассе содержится максимальное количество белка (Золотухин 1970), а при переходе в фазу его содержание снижается до 30% с одновременным повышением содержания ПМК до 60%. Как известно переход микробной культуры из одной фазы роста в другую определяется концентрациями тех компонентов питательной среды, из которых строятся все структурные и функциональные соединения клеток. При этом как низкие, так и высокие концентрации исходных для биосинтеза элементов могут подавлять рост клеток. Поэтому поддержание указанных параметров на определённом уровне должно дать той или иной эффект. В предлагаемом изобретении даётся способ решения задачи поддержания концентрации ПМК в биомассе h- бактерий на минимальном уровне.Способ, занимается в следующем: прежде всего для каждого вида устанавливаются оптимальные пару давления Н2,О2,СО2 и концентрации минеральных компонентов (азота, железа, фосфора и микроэлементов), т.е. те, при которых наблюдается экспоненциальной рост бактерий. Например, экспоненциальный рост бактерий Н.eutropha, H. pacilis, H.poutotropka наблюдается при парцион. давлении О2=20-25%, СО2 не менее 10% и Н2=65-70% и концентрации источника азота - около - 0,04М, фосфора - 0,01л, железа не менее 50мг\л. Тоже самое Н2 бактерий является одной из перспективных продуцентов белковых соединений, т.к. содержат высокопитательный белок, по своим свойствам близок к наземным. Получение высококачественной биомассы ранних бактерий представляет большой практический интерес, по сопряжению с рядом технологических трудностей. Помимо трудности обеспечения автотрофного роста культуры водородных бактерий газами (Н2; О2 и СО2) в нужном соотношении, имеется также трудность управления направленности метаболизма этих м\о. В настоящее время проблема управления газовым питанием данных бактерий уже решена (Золотухин Н.В. 1970). Но по-прежнему остаётся нерешённой остаётся фаза получения биомассы, не содержащей полимер (ПГПК). Данное соединение не усваивается животными организмами и вызывает различные паталогические к токсические действия (calloway, curras). Кроме того, установлено, что синтез этого компонента может проходить как при условии наличия необходимых концентраций питательных компонентов, так в дистил. воде в присутствии Н2; О2 и СО2, имеет место при росте бактерий Н.flava, H.vitrea, H.nuhlandii, но при парциальном давлении О2 около 10%. Отклонения указанных параметров в ту или иную сторону заметно на росте водородных бактерий. Например, увеличение парц. давл. О2 выше оптим. значений останавливает рост бактерий (Золотухин, 1970), а снижение парц. давления в 2-3 раза приводит к образованию ПМК в биомассе (Schuster, Schlegel). В случае поддержания на соответствующих уровнях концентраций раствор. газов и минер. комп. в течении всего периода роста бактерий обеспечивает синтез преимущественно белков (70%), нуклеиновых кислот (15-20%), полисахаридов (3-5%), содержание ПМК при этом может колебаться от долей до нескольких процентов. Для получения биомассы, не содержащей ПМК, необходимо лишать периодически растущие клетки источника углерода. При этом ПМК, имеющаяся в клетках, распадается, а её мономеры используются в белковом и др. синтезах. Таким образом, предлагаемый способ значительно повышает эффективность процесса получения биомассы (Н\бактер. и её качества). Способ выращивания Н бактерий в автотрофных условиях, с целью повышения скорости роста и снижения концентрации ПМК в получаемой биомассе:
1. выращивания бактерий ведётся при таких концентрациях газообразных и минеральному компонентов, которые соответствуют экспоненциальному росту клеток.
2. способ по 1. отлич. тем, что для полного устранения ПМК из биомассы растущую культуру периодически лишают внешней углекислоты, при наличии остальных компонентов питания в количествах, не лимитирующих рост.
Замечания
1) Стр.2 реакции 1-5
а) Потенциал платины реакция 1, прямо зависит от парциальные давления Н2 и экспоненциально от ан +
Е=RT\2F*lnpH2 - RT\F*lnaн + (А)
поэтому отношение Н2\О2 может быть постоянным при постоянном рН.
б) Реакции 3, 4, 5 включает в рассмотрении только действием (О2) кислорода на водород с испарением электроном Н0 на платине, который, т.к. ан + мала -10-6 -7 мала, в основном получается от молекулярного водорода Н2 которым продувается суспензия бактерий. Естественно, что поскольку действие О2 связано с первым члеом правой части уравнения (А) то Е зависит линейно от отношения парциального давления Н2 и О2 опять же при условии постоянного рН (-lgан+).
в) Реакция (2) включает концентрацию примесей П, которая в среде с биомассой может иметь на постоянные значения, причём если имеется ряд примесей (П), то потенциал для примесей выражается следующим образом:
Ered\ov= E0 + Rt\nF*ln(aп1ok*aп2ok...*aпnok\aп1red*aп2red...*aпnred) (Б)
до реакции п1red+ п2red+....+ пnred=п2red+....+ пnred+ne
г) Для исключения влияния окислительного потенциала среды и примесей необходимо было проводить аналогичные измерения е золотым электродом на котором не протекают реакции 1,3,4,5. Реакция 1 на платине протекает в две стадии: Н2 -к1-2Н0-к2-2Н+ +2е (В)
в то время как на золоте водорода с неопареным электроном Н0 не образуется.
д) Следовательно применимость метода к данным условиям строго не доказана (не исключена реакция В).
2) Поскольку метод обобщается на измерении отношения Н2\О2, то из уравнений (А) и (В) и что О2 действует на Н0 с неспаренным электроном (рН2=к[H0]2) вытекает, что при изменении общего парциального давления рН2 и рО2, так чтобы их отношение оставалось постоянным Е должно оставаться постоянным. Однако не приводятся данные которые показывают постоянство Е при различном рН2 и рО2 если отношение рН2\рО2 - поддерживается постоянным.
3) Рис.1. Изменение концентрации биомассы вызывало изменение Е на 20mV, если изменения (рис2) состоянии в среднем 200mV, то погрешность в одиночном измерении могла составить величину + -1%, а погрешность при постоянной биомассе (стр7) + - 0,5%, то общая погрешность + - 1,5%.
4) Рис.3. Показывает изменение рН сред при продувании СО2 которое доходило до единиц рН, что вызывает из формулы (А) изменение потенциала на 60mV, т.е. вносит погрешность 20% от средних отклонений рис2. Из рисунков 8,9,10 количественных заключений о влиянии рН на Е делать нельзя т.к. они приведены в относительных единицах.
5) Возможное влияние рН и примесей делают метод неспецифичным.
Теоретическое и практическое руководство к лабораторным работам по физической химии, г.2 ЛГУ,1967.
Газовые электроды.
Электр. реакции для О2 не Рt
4OH-=O2+2H2O+4e
Yo2=Y0O2 - vlgaон-+ v\4*lgPo2
т.к. Kw=ан+аон-=const
Н2-Н2О-О2
р-р
(Pt)H2(pH2)[водный раствор]O2(PO2)(Pt)
E=Y0O2 -Y0H2 v=2,303 RT\F при 200 v=0,058, при 250 v=0,0589, при 300 v=0,060. Е=Y0'2 +Y0H2 + v\4*lg(Po2*P2Н2).
при Т=const отсюда следует, что э.д.с. О2-Н2-не зависит от состава раствора и его кислотно щелочных свойств, а зависит от парц. давл. Н2 и О2.
Исследование активностей ферментных систем растущей популяции водородных бактерий.
Водородные бактерии являются фак. автотрофами. Автотрафный рост данных характеризуется тем, что при этом используются три газа (Н2, СО2 и О2). И минеральным молекулярный водород в этих условиях роста бактерий служит энергетическим субстратом, углекислота - источником углерода, кислород - конечным акцептором электронов в биоэнергетических реакциях (дыхательные цепи).
Изучения процесса использования указанных газов водородными бактериями представляет большой интерес, т.к. данные таких опытов дают вероятность устанавливать активности ферментных систем, в которых Н2, СО2 и О2 являются начальными продуктами, исследовать связи и зависимости между синтезом биомассы и соответствующих газов, между биоэнергетическими и биосинтетическими реакциями.
Отдел хемосинтеза
В задачу отдела входит изыскание путей повышения продуктивности известных и вновь открываемых литотрофных организмов, создание и разработка установок и технологии производства биомассы тех или иных микроорганизмов для последующего получения белка и других биологически активных соединений.
1) Лаборатория энергетики биосинтеза.
В задачу лаборатории входит исследование биоэнергетических и биосинтетических систем микробной популяции с целью повышения эффективности их работы.
2) Микробиологическая лаборатория.
В задачу её входит выделение различных хемосинтезирующих микроорганизмов из природных источников, изучение свойств этих организмов и оптимальных условий их выращивания, получение мутантов высокопродуктивных по общей биомассе и по конкретным соединениям.
Исследование кинетики роста дрожжей и анализ основных процессов микробиосинтеза с целью повышения качества биомассы
Результаты исследований кинетики роста микроорганизмов являются основой для разработки соответствующего технологического оборудования, средств контроля за ходом микробиосинтеза и систем управления процессом синтеза биомассы. Поэтому значение данных исследований в теоретическом и прикладном аспектах вполне очевидно. Рост микроорганизмов (дрожжей, бактерий и др.) представляет собой полиферменто активный процесс. Это значит, что почти все питательные вещества, показывающие в микробную клетку, подвергаются различной степени превращений под действием синтетических белковых молекул - ферментов и биологических катализаторов. Наиболее глубоким превращениям подвергаются источники основных биогенных элементов: углерода, азота, фосфора, водорода и др., а также источники энергии необходимые всех реакций и процессов, составляющих основу жизнедеятельности любой живой клетки. В принципиальном аспекте наибольший интерес представляют результаты исследования тех внутриклеточных процессов, которые обеспечивают увеличение массы клетки с последующим её делением и, соответственно, качественный состав синтезируемой биомассы. При этом особо важное значение имеют работы по выяснению тех условий, при которых имеет место максимальная скорость синтеза клеточной массы и достаточно высокое содержание в ней целевого продукта, т.е. тех клеточных компонентов, количественное содержание которых характеризует качество получаемой микробной массы. Как известно, основу увеличения клеточной массы при непрерывном функционировании всех систем клетки составляют реакции и процессы синтеза клеточных компонентов: аминокислот и белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот, жирных кислот и липидов, сахаров и полисахаридов, клеточных мембран и оболочек. Иными словами, в клетке сначала идёт синтез наиболее простых соединений - мономеров и их аналогов, а затем идёт "сборка" данных компонентов в полимерные цепи и структуры более высокого порядка. Как показали исследования ряда авторов, скорости синтеза сложных и простых клеточных компонентов могут определяться скоростью одной или нескольких промежуточных реакций превращения исходного субстрата в конечный продукт. Это явление было названо эффектом узкого листа. Установление данного факта позволило применить математический аппарат химической кинетики для описания ряда элементарных биохимических реакций с учётом их особенностей.
Особенности биологической кинетики
По мнению ряда авторов, имеются существенные различия в биологической и химической кинетике. В силу этого имеются и различия химических и биологических моделей.
1. В химии в качестве динамических переменных, как правило, выстраивают концентрации реагирующих веществ. В биологии в зависимости от задачи используются различные динамические переменные: концентрации субстрата, фермента, фермент - субстрактново комплекса, ингибитора, температуры и т.д. Здесь также как и в химии, имеет смысл только положительные значения переменных.
2. Химический процесс обычно разбивается на элементарные стадии, скорости которых зависят от динамических переменных достаточно просто.
В биохимии (микробиосинтезе) элементарным процессом является ферментативный акт. Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации исходных веществ не нолиноминально, т.е. степень полинома, описывающего ферментативную реакцию не всегда совпадает с порядком реакции.
3. В химии, строго говоря, имеют дело с кинетическими системами, в которых рассматриваются лишь элементарные акты взаимодействия, исключающие автокатализ. В биологии же, при описании размножения клеток, авто репродукция (эквивалентная химическому автокатализу) представляет собой типичное явление.
4. Пространственная неоднородность и связанные с нею эффекты играют в биологии большую роль, чем в химии. Дело в том, что большинство биологических процессов локализовано в определённых участках клетки, которые отделены друг от друга мембранами. Эта гетерогенность пространства имеет очень важное значение для прохождения процессов жизнедеятельности и их математического описания.
5. В обычных химических процессах число молекул любого из участвующих веществ, как правило, очень велико: порядка числа Авагадро n=6-1023. Это связано с масштабами процесса и размерами сферы реакции. В биологии размеры сферы реакций значительно меньше. Число участвующих в реакции молекул может быть и не очень велико и в некоторых случаях их могут быть порядка единицы. При этом само понятие "концентрация" требует специального обсуждения. В этих случаях удобнее использовать вероятность нахождения молекулы в том или ином состоянии.
Простейшие ферментативные процессы и их математическое описание
Для того, чтобы перейти к исследованию кинетики таких сложных процессов как микробиосинтез, рассмотрим сначала наиболее элементарные химические и биохимические реакции с участием катализаторов и ферментов. Кинетическое управление для типичной реакции, в которой участвует вещество А и катализатор С, имеет вид V=кас=к1а , (1) где
V- скорость реакции,
а, с- концентрации вещества А и катализатора С соответственно,
к- константа реакции,
к1=кс
Данная реакция является биомолекулярной, хотя и описывается кинетическим уравнением первого порядка. Несколько иная ситуация имеет место в том случае, если на первой стадии реакции катализатор соединяется с исходным веществом, а на последующей стадии освобождается с образованием продукта реакции. В этом случае имеем: А+С=Х - Р+С (2), где кинетические уравнения, описывающие образование (убывание) А,Х,С и Р имеют вид:
- da/dt=k1ac - k2x (3)
dx/dt=k1ac - (k2+k3)x (4)
dc/dt=(k2+k3)x - k1ac (5)
dP/dt=k3x (6)
плюс уравнение баланса С0 = с+х (7), где
к1, к3, к5.....к2n-1 - константы реакций в прямом направлении.
к2, к4, к6.....к2n - константы реакций в обратном направлении.
Через определённый промежуток времени от начала реакции достигается стационарное состояние, при котором концентрация комплекса Х остаётся практически постоянной, т.е.
dx/dt=0=k1ac - (k2+k3)x или k1ac=(k2+k3)x (8)
Подставляя вырадение для С из уравнения (8) в уравнение (7), получаем
х=k1ac0/(к1а+к2+к3) (9)
Постановка этого выражения в уравнение (6) приводит к основному уравнению
V= - da/dt=dP/dt=k3x= k1k3aC0/(k1a+k2+k3)= k3C0a/( k2+ k3)/(k1+a) (10)
или V= Va/(ka +a ) (11)
где V=k3C0 и kа=(k2+k3)/k1. Интеграция уравнения (11), получаем
Vt=kalna0/a + (a0-a) (12)
На рис. показано графическое изображение зависимости, описываемой уравнением (11).
Рис. Кривая выражающая зависимость между скоростью реакции и концентрацией при V= Va/(Ka+a).
Как видим из рис., кривая зависимости V от а в прямоугольных координатах представляет собой гиперболу, форма которой полностью определяется двумя кинетическими константами ( или параметрами): V и Ка. Первая из этих констант есть предельная скорость реакции при а - бесконечность и, таким образом, имеет размерность концентрации, делённой на время; вторая константа, Ка, числено равна концентрации вещества А, при которой V=V/2; она имеет размерность концентрации (М). Описанная зависимость скорости химической реакции с участием катализатора легла в основу описания кинетики реакций, катализируемых ферментами. Именно этот тип реакций обеспечивает ростовые и другие процессы у растущих клеток - микробных или других. Начало исследованию этого типа реакций было положено Михаэлисом-Ментен и которыми впервые было выведено уравнение (11).
Кинетика реакций, катализируемых ферментами
Согласно современным представлениям, механизм ферментативных реакций в клетке протекает по схеме:
А+Е = Х = Е+Р, (13)
где А- исходный субстрат
Е-фермент
Х- фермент-субстратный комплекс
Р- продукт ферментативной реакции
Кинетические уравнения, соответствующие данному механизму реакций, будут иметь вид:
- da/dt=k1aе - k2x (14)
dx/dt=(k1a + k4Р)е - (k2+k3)x (15)
dе/dt=(k2+k3)x -(k1a+k4Р)е (16)
dP/dt=k3x - k4Ре (17)
е0=е + х (18)
Для стационарного состояния, которое достигается, если е0<<a и (или) р, dx/dt=dе/dt=0, имеем уравнение (k1a + k4Р)е =(k2+k3)x (19)
Совместно с уравнением (18) оно даёт для е и х выражения
х=(k1a + k4Р)е 0/Д ; е=(k2+k3)е0/Д (20)
где Д=k1a + k4Р + k2+k3. Подставляя полученные значения в уравнение (14) или (17), получаем
Vр=0= k1k3aе0/((k2+k3)+к1а)= V1a/( kа+ а)= V1/((Ка+а)+1) (22)
где V1 - предельное значение скорости прямой реакции. Если же принять, что а=0, то уравнение (21) сводится к уравнению Михаэлиса-Ментен, включающую начальную скорость V2 обратной реакции:
(V2)а=0= k2k4ре0/((k2+k3)+к4р)= k2е0р/((k2+k3)/k4+р)=V2Р/( kр+ Р)= V2/( kр/Р+ 1) (23)
где V2 - предельное значение скорости обратной реакции.
Для этого примера можно рассчитать такие значения индивидуальных данных скорости на основании экспериментально наёденных значений Ка, Кр, V1 и V2 при условии, что известна величина е0, т.е. общая концентрация фермента, катализирующего биохимическую реакцию. При этом:
К1= (V1+V2)/Кае0; К2=V2/e0; К3=V1/e0; К4=(V1+V2)/Kpe0; (24)
В большинстве случаев с увеличением концентрации продукта ферментативные реакции замедляются. Это является одним из примеров биологической саморегуляции на основе отрицательной обратной связи. Иными словами, даже при самых благоприятных условиях в клетке не происходит синтеза какого-нибудь компонента беспредельно, т.е. количества клеточных компонентов, синтезируемых в системах ферментативных реакциях, строго регламентируется. Чтобы лучше представить это, напишем кинетические уравнения несколько в иной форме:
V=(kpV1a - kaV2P)/(kakp+kpa+kaP)= V1-V2 (25)
где V1- скорость прямой реакции
V1=V1a /(ka+a+kaP/kр) (26) или
1/V1=ka/V1*1/a *(1+P/kр)+1/V1 (27)
а V2 - скорость обратной реакции
V2= -V2Р /(kр+Р+kра/kа) (28)
1/V2=kр/V2*1/Р *(1+а/kа)+1/V2 (29)
Здесь получился симметричный набор уравнений, из которого следует, что ферментативная реакция замеряется по мере приближения к равновесию не только ввиду наличия обратной реакции (член со знаком минус в числителе уравнения 27, но также из-за того, что возрастание концентрации продукта приводит к уменьшению концентрации свободного фермента. Таким образом, кинетический эффект ингибирования продуктом реакции присущ любому реальному, т.е. обратимому, механизму ферментативного катализа. Влияние этого эффекта представлено на рис. в графической форме. Данная форма получена на основе метода Лайнуивера-Берка, по которому гиперболическая зависимость скорости реакции от концентрации субстрата преобразуется в линейную.
Рис. Влияние продукта на кинетику ферментативной реакции.
Из данных рисунка видно, что отрезок, отсекаемый прямыми на оси ординат не меняется, но наклон прямой увеличивается на некую постоянную величину (1+ Р/Кр). Зависимость такого типа характеризует так называемое конкурентное ингибирование. Конкурентное ингибирование проявляется всякий раз, когда ингибитор соединяется только с той формой фермента, с которой соединяется субстрат, т.е. фермент может образовать два вида комплексов: фермент-субстрат (ES) и фермен-ингибитор (EI). В рассматриваемом случае (см. уравнение 13). Как Р так и А соединяются с Е, но ни один из них не соединяется с Х. Рассмотренные примеры ферментативных реакций и их математическое описание приемлемы для простых случаев, имеющих место и в живой клетке. Тем не менее, на практике данные математические модели ферментативных процессов не всегда адекватны наблюдаемым. Это особенно касается тех процессов, которые составляют основу непрерывного увеличения микробной массы общей численности клеток и их общей массы). За счёт непрерывного поглощения клетками питательных веществ, находящихся в окружающей среде.
Кинетические особенности растущей микробной популяции
В химических реакциях, идущих с участием катализатора, количество последнего в ходе процесса не меняется. В микробиологической кинетики количество ферментов, катализируемых реакции в ходе роста клеточной популяции, непрерывно возрастает. Этот факт делает не приемлимыми уравнения Михаэлиса-Ментен для описания роста микробной популяции. В связи с этим рядом авторов уравнения Михаэлиса-Ментен были модифицированы для случая, когда количество фермента в ходе процесса непрерывно возрастает. Многочисленными опытами по исследованию роста микроорганизмов в периодической культуре было показано, что рост их биомассы во времени неравномерен и описывается S-образной кривой (см.рис.)
Рис. Изменение концентрации биомассы в процессе роста микроорганизмов в периодической культуре.
Как показали анализы данной зависимости рост биомассы Х(t) при этом описывается уравнением, характеризующем автокатализм:
dx/dt=mx (30)
где х- текущая концентрация микроорганизмов, m- коэффициент пропорциональности, который не обязательно является константой.
Решая уравнение 30 относительно m, имеем
m=dx/dt*1/x (31)
Следовательно m есть величина, равная скорости прироста биомассы за определённый промежуток времени зелёной на текущую концентрацию микроорганизмов. Эта величина получила название удельной скорости биомассы. Основываясь на представлениях ферментативной кинетики. Леоно предложил уравнение, описывающее рост микроорганизмов в зависимости от концентрации субстрата, которая имеет вид
m=mшS/(Ks+S) (32)
где m- текущее значение удельной скорости роста биомассы.
mш- максимальная скорость микроорганизмов конкретного вида.
Ks- константа, численно равная концентрации субстрата, при которой скорость роста клеток равна половине максимальной.
S- концентрация субстрата.
Исследуя уравнение 32 и сопоставляя расчётные данные о экспериментальными, Н.Д.Иерусалимский установил, что в ряде случаев наблюдается отрицательное влияние синтезируемого клетками продукта на скорость их роста. Автором была предложено уравнение, учитывающее данный факт и которое имеет следующий вид
m=m0Кр/(Kр+Р) (33)
Это уравнение описывает зависимость удельной скорости роста биомассы от концентрации продуктов метаболизма. Объединяя уравнения 31 и 33, получаем известную формулу Леоно-Иерусалимского. На рис. также показано изменение удельной скорости роста микроорганизмов по фазам их роста. Видно, что максимальное значение m приходится на экспоненциальную фазу роста микроорганизмов. Этот факт затем используется при непрерывном выращивании микробов. Для чего сначала определяют концентрации субстрата при которых имеет место максимальная удельная скорость роста микроорганизмов и соответствующие коэффициенты. Затем субстрат подают в аппарат с такой скоростью, при которой рост микроорганизмов остаётся на заданном уровне. Этот режим в общих чертах описывается следующей системой уравнений.
dx/dt=m(S)x -Д'(х) (а)
dS/dt= -dm(S)x - Д'(S0-S) (б)
m(S)=mшS/(kш+S) (в)
Где S - концентрация субстрата; х- концентрация клеток, в аппарате; S0- концентрация субстрата, поступающего в аппарат, Д'-скорость подачи среды в аппарат. d- часть субстрата, идущая на построение биомассы. Член m(S)x в уравнении (а) представляет собой прирост биомассы за счёт поглощения субстрата, -Д'(х) - отток биомассы из аппарата. В уравнении (б) член dm(S)x характеризует количество субстрата, поглащёного клетками, Д'S0- приток субстрата в аппарат, Д'S- отток неиспользованного субстрата из аппарата. При этом скорость роста биомассы m предполагается зависящей только от концентрации субстрата в соответствии с формулой Моно (в).
m=mшS/(ks+S)(1+P/Kp) (34)
Это выражение для удельной скорости роста биомассы во многих работах принять за основу для дальнейшего её развития за счёт ввода дополнительных членов, учитывающих те или иные допущения. Применительно к дрожжам или другим гетеротрофам для вычисления удельной скорости их роста необходимо знать концентрации субстрата, клеток, продукта (например, СО2), а также константы Кs и Кр.
Основные процессы микробно синтеза, обеспечивающие качественный состав биомассы
Вышеприведённые кинетические уравнения, в основном описывают процесс на уровне элементарных ферментативных реакций и общего поведения микробной популяции при её росте в периодической или непрерывной культуре. Очевидно, что эти математические модели процессов ни в коей мере не отражают основного свойства синтезируемой биомассы - её качественного состава. Поэтому, для понимания "внутренних" характеристик процесса микробиосинтеза, представим его в виде некоторой системы последовательностей ферментативных реакций синтеза конкретных клеточных компонентов. Как известно, биомасса клеток складывается из белков, нуклеиновых кислот, липидов и других соединений. Все они в конечном итоге синтезируются из сравнительно простых молекул и ионов, имеющихся в окружающей среде. Данные вещества, попадая в клетку, распределяются между отдельными ферментными системами, конечным результатом действия которых являются продукты превращения внешних источников веществ и энергии в соответствующие клеточные компоненты. Или могут быть (в простейшем случае), например, мономеры: аминокислоты, нуклеотиды, жирные кислоты, карбоновые кислоты и т.д. В результате действия ферментных систем указанные вещества полимезируются, образуя основную клеточную массу. Данный процесс схематично представим следующим образом. В качестве исходных веществ для микробиосинтеза примем среды, используемые на заводах производящих кормовые дрожжи, например, гидролизаты растительного сырья. Итак, в данном случае имеем: сахара+аммиак+фосфор+микроэлементы и дрожжи. В последних содержаться все ферменты, необходимые для превращения исходного сырья в клеточные компоненты. Процессы синтеза данных компонентов можно представить следующим образом
S V1E1-S1V2E2-S2V3E3-S3V4E4-...АТФ (энергия)
(NH3+АТФ+S) V1'E1'-S'1V2'E2'-S'2V3'E3'-S'3V4'E4'-...аминокислоты
(аминокислоты+АТФ) V1''E1''-S''1V2''E2''-S''2V3''E3''-S''3V4''E4''-...белки
(NH3+АТФ+P+S)
(нуклеотиды+АТФ) кислоты
и т.д.
Из приведённых реакций видно, что субстрат, попадая в клетку претерпевает глубокие химические превращения под действием многочисленных ферментов. Все они в клетке обладают строгой специфичностью и, вероятно, образуют особые функциональные системы. В случае дрожжей, используемых как кормовые, их качество будет определяться процентным содержанием в них аминокислот и белков.
АППАРАТ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ АБТ
Подпись к рисунку
Схема аппарата с перфорированной системой воздухораспределения
УДК 630.863.5.002.5
Н.В.Золотухин, кандидат биологических наук, Э.М. Якубов, кандидат технических наук, А.В.Юлдашев, младший научный сотрудник
ПРОСТОЙ АППАРАТ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Типичными конструктивными особенностями действующих и предлагаемых аппаратов для выращивания микроорганизмов являются наличия в них перемешивающих и теплообменных устройств. Описания таких конструкций приведены в ряде работ. Анализ работы данных аппаратов показывает то, что их разработчики преследуют одну главную цель - как можно более интенсивно перемешивать жидкую культуру микроорганизмов с надеждой получения желаемого биологического эффекта. Но, как показывает практика, затраты энергии при этом не адекватны получаемому биологическому эффекту, т.е. для получения очередной единицы прироста значения биологического эффекта затраты энергии на перемешивание становятся гораздо большими, чем при получении предыдущей единицы. Это несоответствие можно объяснить тем, что все процессы синтеза биомассы в микробных клетках осуществляется внутри неё. Сама же клетка контактирует с окружающей средой через полупроницаемую мембрану. Последняя обладает тем свойством, что независимо от внешней ситуации она активно регулирует поступление тех или иных соединений в уито плазму, концентрации которых могут значительно отличаться. Например, концентрация ионов калия в клетке может в десятки раз превосходить его содержание вне клетки, а прохождение многих внутриклеточных процессов может осуществляться без всякого активного воздействия на среду, окружающую клетки. Например, на твёрдых средах в чашках Петри микроорганизмы растут буквально находясь друг на дружке. При этом все питательные компоненты они получают из агаризованной среды, а кислород - из окружающей атмосферы, т.е. в данном случае активный рост микробных клеток обходится без всяких активных воздействий на окружающую среду. В случае жидких сред, содержащих легко растворимые питательные компоненты, рост микроорганизмов будет, очевидно, ограничиваться концентрацией того компонента, значения которой находятся ниже оптимальной. Для аэробных микроорганизмов таким компонентом является кислород, содержание которого в среде ограничено его низкой растворимостью и низкой скоростью диффузии. Первый барьер практически снять невозможно в силу действия физико-химических законов (при неизменном давлении, например, внутри аппарата). Второй же барьер может быть устранён разными способами, один из которых будет рассмотрен ниже. В настоящем сообщении приведены и обсуждены результаты исследования промышленного получения дрожжей из гидролизатов растительного сырья и минеральных солей в условиях Янгиюльского биохимического завода и дано решение задачи по стабилизации роста дрожжей и увеличению удельной производительности аппарата. Производство дрожжей на ЯБЗ и родственных ему заводах основано на использовании гидролизатов растительного сырья с предварительными их нейтрализацией и обогащения минеральными солями. После этих операций полученная среда разбавляется водой до концентрации продуктов гидролиза 8-9 г/л, т.е. в 2 с лишним раза против исходной. Необходимость такого разбавления диктуется принятой на ЯБЗ технологией, по которой более высокие концентрации продуктов гидролиза приводят к значительному их недоиспользованию и, следовательно, и большим их потерям. Кроме того, аэрирующая система, действующая на ЯБЗ и других гидролизно-дрожжевых производствах имеет существенные недостатки. Во-первых, она не способна одновременно обеспечивать кислородом весь рабочий объём, т.е. всю микробную культуру, находящуюся в аппарате. Это обусловлено тем, что кислород (воздух) подаётся в несколько точек на высоте примерно 1 метр от днища аппарата. Поэтому основная масса дрожжей постоянно испытывает дефицит по кислороду. Учитывая же то, что в 1 см3 среды находится несколько миллионов клеток, для непрерывного роста которых необходимо постоянное наличие всех питательных компонентов в окружающем их пространстве, отсутствие одного из них может значительно изменить скорость роста клеток и направленность их метаболизма. В случае же отсутствия кислорода в среде, очевидно полностью остановит все процессы биосинтеза, идущие с затратами энергии. Во-вторых, мощные потоки воздуха (50 м3/час/м3 рабочей жидкости и более) вызывают обильное пенение и флотацию дрожжей. Это приводит к значительным затратам пеногасителя на стадии выделения биомассы. Сама же пенная фаза 2/3 общего объёма аппарата, что значительно снижает его удельную производительность и вынуждает строить аппараты большой высоты (до 16м). Наличие мощной пенной фазы и большая высота аппарата вызывают большие неудобства в обслуживании аппаратов и затрудняет работу технологического оборудования и не дают возможности максимально автоматизировать производство. Учитывая то, что микробные клетки, в том числе и дрожжи, в жидкой культуре даже при лёгком встряхивании быстро переходят во взвешенное состояние, нами были исследованы возможности во взвешенное состояние, нами были исследованы возможности равномерного обеспечения в таких условиях растущих микроорганизмов кислородом без значительных энергетических затрат. В результате этих исследований мы пришли к выводу, что наиболее эффективным способом непрерывного обеспечения аэробных микроорганизмов кислородом (воздухом) является непрерывное его пропускание в виде мелких пузырьков по всему горизонтальному сечению ёмкости, содержащую жидкую микробную культуру. На основе этого нами был разработан, изготовлен и испытан на ЯБЗ аппарат, в котором насыщение среды кислородом осуществляется мелкими воздушными пузырьками. Они получаются при помощи дробления воздушного потока перфорированной системой, представляющей собой набор плоских перфо элементов с соответствующим их расположением внутри аппарата (см.рис.). Как следует из данных рисунка, питательная среда и воздух подаются в аппарат снизу, в вершину конического днища аппарата. Примерно в середине конуса укреплён первый перфорированный элемент. Пройдя сквозь данный элемент, жидкость и газ взаимо смешиваются. В основании конуса расположен второй перфо элемент, выполняющий ту же роль, что и первый. Причём, первый и второй перфо элементы в конической части аппарата размещены вплотную к стенкам ёмкости, а сама коническая часть при этом выполняет роль камеры насыщения питательной среды кислородом. В цилиндрической части аппарата перфорированные элементы имеют круговой зазор между своими краями и стенкой ёмкости. Их назначение состоит в следующем. Пузырьки воздуха, поднимаясь вверх, как бы вспучивают жидкость и заставляют её растекаться к стенкам ёмкости. Но в силу непрерывности воздушного потока жидкость в аппарате испытывает постоянную циркуляцию по контуру: низ-верх-низ. Именно данная циркуляция обеспечивает равномерность распределения микробных клеток и всех питательных компонентов, включая кислород, по всему рабочему объёму аппарата. В данном случае не требуется излишнего расхода воздуха. Все микробные клетки находятся во взвешенном состоянии в жидкости. При этом появляется возможность исключать флотацию микроорганизмов и значительно упрощать выделения биомассы без всяких её потерь на данной стадии. Аппарат данной конструкции был изготовлен на ЯБЗ в двух вариантах: объёмом 10 и 1200л. В обоих случаях были получены одинаковые результаты, а именно:
- микробиологические характеристики дрожжевых культур, применяемых на ЯБЗ, гораздо устойчивее, чем в промышленных аппаратах;
- выход дрожжей с единицы основного субстрата 2-50-55%;
- расход воздуха на 1 м3 дрожжевой культуры составил 10-15 м3;
- коэффициент наполнения аппарата равнялся 75-85%;
- удельная производительность аппарата при концентрации основного субстрата (сахаров) в среде 9 г/л достигала 1,0-1,2 кг/час/м3, а при концентрации основного субстрата 18 г/л эта величина достигала 2,0-2,4 кг/час/м3.
Полученные данные указывают на то, что существующая технология получения кормовых дрожжей из гидролизатов растительного сырья и её современное аппаратурное оформление, являются крайне не совершенны. Это несовершенство проявляется, в частности в больших энерго и металло ёмкостях, громоздкости аппаратов, больших потерях товарного продукта (10-15%) на стадии выращивания и выделения дрожжей и др. В рассмотренном же варианте эти недостатки исключаются полностью. Кроме того апробированный нами вариант системы воздухораспределения, а также принятый нами вариант подачи жидкости и газа снизу, а отбор дрожжей сверху дают возможность резко увеличить удельную производительность аппарата за счёт использования высококонцентрированных сред, значительно снизить объём сточных вод вплоть до полного их исключения и снизить затраты при этом в энергии и металле в 2-3 раза в сравнении с существующими. Кроме того, простота и надёжность конструкции рассматриваемого аппарата могут послужить основой для создания промышленного варианта и реконструкции ныне действующих аппаратов, для получения аэробных микроорганизмов с использованием питательных растворов с легкорастворимыми компонентами.
"Утверждаю"
Главный инженер Янгиюльского
Биохимического завода
_________ В.Н.Зырянов
"2" мая 1985г.
МЕРОПРИЯТИЯ
на пусковой период опытно-промышленной установки с перфорированной системой воздухораспределения для выращивания кормовых дрожжей (У=50 м3), проводимые ИК с ВЦ АН УзССР на 1985 год
№
п/п l Наименование этапов l Сроки выполнения l Отв. исполнители l
1 l 2 l 3 l 4 _
1. Произвести ревизию и замену запорной арматуры на до 30 апреля Золотухин Н.В.
аммиачной, сусловой и воздушной линиях Миронов В.В.
2. Провести отладку работы насоса марки 4к-1с 45/32 в до 30 апреля Миронов В.В.
системе пеногашения
3. Установить систему непрерывной регистрации рН до 30 апреля Золотухин Н.В.
прибором Алиев И.У.
4. Испытать систему пеногашения в непрерывном режиме до 15 мая Золотухин Н.В.
выращивания дрожжей Миронов В.В.
Шатохин А.К.
5. Обработка технологического режима на установке до 15 июня Золотухин Н.В.
Зырянова А.Г.
6. Техническое обслуживание установки в период Миронов В.В.
испытаний
СОГЛАСОВАНО:
Начальник дрожжевого цеха К.Х.Юлжашев Зав. лаборатории ИК с ВЦ Ан УзССР Э.М. Якубов
Старший научный сотрудник ИК с ВЦ АН УзССР Н.В. Золотухин
Изменения концентраций биомассы, белка, источника энергии и углерода (S2), фосфата (S2) и аммония (S3) в периодической культуре дрожжей.
Зам. директора ИК с ВЦ АН УзССР Авторы: Н.В.Золотухин, Э.М.Якубов, А.Н. Филатов
ВОЗРАЖЕНИЕ
против решения Государственной научно-технической экспертизы по заявке №2452084 (018815)
В соответствии с пп. 21 и 25 положения об открытиях, изобретениях и рац. предложениях, утвержденном постановлением СИ СССР от 21.08.73 №584, авторы заявки имеют следующие возражения по вышеназванному решению.
1. Основной противопоставляющий аргумент в решении - ссылка на авт. св. №406875, кл.С12,1971.
По данному авт.св. даётся описание способа управления процессом рассиропки, целью которого является повышение точности регулирования температуры в распропнике, которую достигают путём подачи холодной и горячей воды в аппарат и связывают её с рассогласованием температуры и плотности рассиропки.
Целью же изобретения, предлагаемого в заявке, является снижение затрат на термостабилизацию и оптимизации микробиосинтеза, т.е. непрерывно растущей и непрерывно растущей и непрерывно выделяющей, но не в одинаковом количестве, тепло растущей культуры микроорганизмов. Поставленная цель достигается путём изменения температуры среды на входе в аппарат и скорости подачи в него среды (одинакового состава) тот или иной температуры в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Таким образом, предмет изобретения, изложенный в заявке, не имеет ничего общего с предметом изобретения по авт.св.№406875. Учитывая внешнее сходство осуществления термостабилизации авт.св.№406875 с сущностью изобретения заявки, вносим некоторые дополнительные разъяснения и примеры технической реализации предлагаемого изобретения. Под словом "среда" в заявке понимается всё то, что необходимо для синтеза биомассы. В случае дрожжей это - сахара, углеводороды, минеральные соли, микроэлементы, растворённые или анульгированые в воде, а также - кислород, подаваемый в аппарат с растущий микроорганизмами в виде воздуха или в смеси с другими газами. В случае же других микроорганизмов, помимо вышеуказанных компонентов питательной среды, могут быть ещё и водород, и углекислый газ, и метан и др. С учётом вышесказанного и кажущегося (внешне) сходства сущности изобретения по авт.св.№406875 с сущностью изобретения, описанного в заявке, предлагаем ещё несколько дополнительных вариантов, более полно разъясняющих сущность предлагаемого изобретения и техническую его реализацию. На рис.1 показан вариант осуществления предлагаемого изобретения когда в аппарат подаётся среда, имеющая температуру выше той, которую необходимо поддерживать в аппарате с растущими микробами. В данном случае её подогревают паром в том случае, когда температура в аппарате падает ниже оптимума. Заметим, что температурный оптимум для роста микроорганизмов имеет более широкий интервал, чем в химической технологии (см. руководства по физиологии микроорганизмов). Поэтому жёсткая термостабилизация в данном случае не требуется, а большая инерционность в изменении параметров микробиосинтеза в данном случае позволяет обеспечить для него необходимый режим. Данный вариант удобен, например для подогрева водной среды. На рис. 2 показан вариант подогрева газообразных сред внутри аппарата когда их температура также значительно ниже температуры культуральной среды. На рис.3 показан вариант подогрева как жидких, так и газообразных сред. По данному варианту среда может иметь два входа в аппарат: один с подогревом, а другой с охлаждением.
Примеры поддержания заданной температуры в ферментере при непрерывном выращивании микроорганизмов.
Авторы: Н.В. Золотухин
Э.М. Якубов
А. Исмаилов
А. Юлдашев
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет по только списать затраты на обеспечение необходимого температурного режима микробиосинтеза, но и повысить её надёжность (за счёт упрощения) и рабочей объём аппарата (за счёт исключения на него объёма теплообменников) и тем самым повысить его производительность. Что касается замечаний относительно оптимизации микробиосинтеза, то в целом мы с ними согласны. Но поскольку параметр "температура" в микробиологическом процессе в крайних точках интервала его значений приобретает управляющий характер, то мы считаем целесообразным сохранить название изобретения до слов "... в тепло статном режиме". На основании выше изложенного, мы даём следующую редакцию формулы изобретения: "Способ управления ростом микроорганизмов, предусматривающий поддержание концентраций биомассы на заданном уровне, регулирование жидких и газообразных потоков среды и обеспечение заданной точности поддержания температуры в ферментере, отличающийся тем, что, с целью снижения затрат на термостабилизацию и её упрощение, изменение температуры в ферментере осуществляют температурой среды".
Н.В. Золотухин
Э.М. Якубов
А. Исмаилов
А. Юлдашев
ДОГОВОР №41/90
на создание научно-технической продукции
г.Ташкент "24" мая 1990г.
Научно-производственный кооператив "БИОСТАТ", именуемый в дальнейшем Исполнитель, в лице Председателя канд. биол. наук Н.В. Золотухина, действующего на основании устава НИК, с одной стороны и Государственный-кооперативный комитет УзССР по сельскому хозяйству, именуемый в дальнейшем Заказчик, в лице зам.председателя комитета А.Р.Рахманова и начальника управления финансов Т.Ш. Сраджидинова, действующих на основании решения секции животноводства научно-технического совета госкоопкомсельхоза УзССР, с другой стороны, заключили настоящий договор с нижеследующим:
1. ПРЕДМЕТ ДОГОВОРА
1.1. Заказчик поручает, и исполнитель принимает на себя выполнение работы: "Выработать опытную партию продуктов биотехнологической конверсии углеводов сахарной (полусахарной) свеклы и испытать их на животных".
1.2. Срок сдачи работ по договору - 4 квартал 1991 года.
2. СТОИМОСТЬ РАБОТ И ПОРЯДОК РАСЧЁТА
2.1. Для выполнения указанной работы заказчик перечисляет на банковский счёт исполнителя во второй квартал 1990г. 63тыс.руб.
2.2. Полный возврат вышеуказанной суммы заказчику исполнитель производит в четвёртом квартале 1991 года.
3. ДРУГИЕ УСЛОВИЯ
Экономический эффект от использования разработок исполнителя после компенсации затрат заказчика распределяется следующим образом: 30% - предприятию, 10% - заказчику и 60% - исполнителю.
АДРЕСА И РАСЧЁТНЫЕ СЧЕТА СТОРОН
ИСПОЛНИТЕЛЯ: 700100, Ташкент, ул. Б.Хмельницкого 79.
р/с №400461285, МФО 734202 во Фрунзенском жилсоцбанке г.Ташкента.
ЗАКАЗЧИКА: г.Ташкент, ул. Навои 4. Р/с 000569146 ОПЕРУ АПБ г.Ташкента.
От заказчика: А.Р.Рахманов, Т.Ш.Сраджидинов от исполнителя: Н.В.Золотухин
Протокол №3 от 23.04.90г.
ПЕРВОМУ ЗАМ.МИНИСТРА СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН А.А.ЮЛДАШЕВУ
При этом прилагаю отчёт НПК "БИОСТАТ" о работе по договору 41/90 за 1991-92 гг (9 стр.) и акты по полученным результатам (в 2-х экз.).
Директор НПК 13.02.1998г. Н.В.Золотухин
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КООПЕРАТИВ "БИОСТАТ" 700015 ТАШКЕНТ, УЛ. РАБОЧАЯ, Д.24
ОТЧЁТ
о ходе выполнения работ по теме: "Выработать опытную партию продуктов биосинтетической конверсии углеводов сахарной (полусахарной) свеклы и испытать её на животных". (Договор № 41/90 от 24 мая 1990 года)
ТАШКЕНТ - 1992
СОДЕРЖАНИЕ Стр.
1-2
Сахарная свекла как исходной сырьё для производства высокоактивных кормовых добавок....... 3-4
Дрожжи как физиологически активная кормовая 5-6
Некоторые практические 7-9
ВВЕДЕНИЕ
Как показала история и практика хозяйственной деятельности человека решения проблемы обеспечения людей широким ассортиментом высококачественных продуктов животного и растительного происхождения представляют собой обеспечение условий для максимальной продуктивности всех видов животных и растений, используемых человеком в качестве источников пищевых продуктов. Продуктивность же растения и животных прямо зависит от качественного и количественного набора исходных питательных компонентов для каждого вида организмов и поддержание соответствующих соотношений этих компонентов в почве (для растений) и корме (для животных). Нарушение этих условий напомнить, для увеличения своей массы и достижения полной зрелости растению необходимо постоянное наличия доступной энергии, например, энергия электромагнитного излучения Солнца или другого источника света или глюкозы (в ночные часы). Далее, необходим источник углерода, каковыми являются углекислый газ или карбонаты или различные органические соединения, например, перегнивший навоз, растительные остатки и т.п. Для синтеза в организме растительного организма необходим источник конструктивного и "энергетического" водорода (он получается из воды после её фенэргетического водорода (он получается из воды после её фотоэлектролитического разложения на кислород и водород). Для синтеза азотосодержащих соединений (аминокислот, белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот) необходим источник азота (аммиачные соли- аммофос и др.). Ну, а для синтеза, во испроизведения нового наследственного материала клеток необходим источник фосфора (таковыми например являются калийные, натриевые, аммонийные слои фосфорной кислоты и др.). Наличие всех перечисленных компонентов в почве в нужном количестве и соотношении является необходимым условием для обеспечения максимальной продуктивности растительных организмов. При этом все микроэлементы, входящие в активные центры клеточных ферментов или участвующие в жизненно важных реакциях и процессах также должны быть доступны растительному организму. Для питания животных и обеспечения их максимальной продуктивности в их кормовом рационе необходим полный набор органических соединений таких как углеводы и жиры (источник энергии, конструктивных углерода, кислорода и водорода), азотсодержащие соединения (полный набор незаменимых аминокислот, белковые вещества, нуклеотиды и др.) и набор микроэлементов (солей железа, калия, кальция, магния, серы и т.д.). Наличие перечисленных питательных компонентов в кормовом рационе в определённом количестве и соотношении обеспечивает условия для максимальной скорости синтез биомассы (привесы) и целевых продуктов (молоко, яйца, шерсть и др.). Игнорирование вышеперечисленных положений всегда будет заводить в тупик или ставить дело на ложный путь. Программа "Биостат" в данной части основана на объективной информации о работе биоэнергетических, биосинтетических и генетических системах клетки в различных условиях её существования. Эта информация основана на результатах прямых измерений и определений величин параметров, обеспечивающих ту или иную скорость прохождения биоэнергетических и биосинтетических (привесы) процессов в нормально функционирующих клетках. Методы получения такой информации зафиксированы авторскими свидетельствами, а большинство из них находятся в НПК "БИОСТАТ" в форме "ноу-хау".
Целью настоящей работы было:
1) практическое определение максимальной продуктивности сахарной свеклы на полевых землях Узбекистана,
2) проверить известные данные об увеличении продуктивности животных при добавлении в их кормовой рацион дрожжей,
3) разработать усовершенствованный вариант биореактора для превращения углеродов сахарной свеклы в дрожжевую биомассу.
САХАРНАЯ СВЕКЛА КАК ИСХОДНОЕ СЫРЬЁ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОАКТИВНЫХ КОРМОВЫХ ДОБАВОК.
Одной из первоочередных задач в своей деятельности научно-производственный кооператив "БИОСТАТ" (зарегистрирован 25.01.90г.) поставил кардинальное решение проблемы кормов для сельхозживотных нетрадиционными способами. С этой целью была разработана программа "БИОСТАТ", основу для разработок различных биотехнологий применительно к целому растительному и животному организмам. В качестве исходного сырья в решениях кормовой проблемы НПК выбрал сахарную свеклу. Выбор пал на эту культуру не случайно. Сахарная свекла имеет большие преимущества перед другими кормовыми (травинными и др.) источниками. Во-первых, она обладает способностями наращивать свою биомассу до многих сотен центнеров на гектаре земли. Во-вторых, в её корнеплодах накапливается большое количество сахаров (до 18 и более процентов в сырых корнеплодах). В-третьих, известно, что сахара являются универсальными источниками энергии и служат исходным "кирпичиком" практически во всех процессах синтеза биомассы животного организма, да и растений тоже. Иными словами, глюкоза является одним из основных химических соединений, из которых строятся все мышечные, печёночные, сердечные, желудочно-кишечные, нервные и другие ткани животного организма. Поэтому, располагая значительным количеством сахара и владея биотехнологическими способами превращения его в конкретные компоненты, составляющие массу животного, можно решать сугубо практические задачи. Например, получение качественных кормов путём обогащения низкокачественных кормов свекольно- дрожжевыми добавками. Сахарная свекла в Узбекистане не культивируется вот уже несколько десятков лет. Поэтому перед НПК "БИОСТАТ" первейшей задачей было нахождение и приобретение семян высокоурожайных сортов сахарной свеклы. Свекло сеящие регионы бывшего Союза довольно обширны и находятся в различных географических зонах. Южный Казахстан, Северный Кыргыстан, Кубань, Дон, Украина, Центральная Россия и Поволжье - таков спектр свекло сеящих регионов. С рядом из них мы и ознакомились. Было совершено несколько поездок в Джамбульскую область, на Кубань, Ростовскую область, Белгородскую область, в периоды посева, активной вегетации и уборки урожая сахарной свеклы. Наши наблюдения показали, что в разных регионах урожая сахарной свеклы значительно разнятся и колеблются между 100 и 500 ц/га. Такие колебания урожайности свеклы обуславливаются не только сортовой принадлежностью, но и в значительной степени качеством агротехнологических и агротехнических приёмов. В одном из хозяйств Краснодарского края (АПК "Кубань") мы ознакомились с полями, на которых были высажены семена, полученные из-за рубежа. Особенность этих семян состояла в том, что они гибридные, одноростковые и предварительно обработаны специальными препаратами, которые в последствии предотвращают вегетирующее растение от различных заболеваний и насекомых- вредителей. Кроме того, данные сорта обладают тем свойством, что урожайность и сахаристость корнеплодов прямо зависит от сроков уборки. В результате этих поездок были приобретены два импортных одноростковых сорта семян и один сорт в Джамбульской области. Все семена были высеяны в с/х им. 5-летия УзСССР. При этом не были соблюдены полностью все агротехнологические и агротехнические приёмы из-за отсутствия необходимой техники и информации. К тому же семена были приобретены в мае месяце 1991 года. В 1990 же году НПК не смог обеспечить семена, т.к. договор был подписан в конце мая 1990 года, а финансовые средства поступили на счёт НПК лишь в июне месяце того же года. Своих же средств в требуемом количестве мы не имели. Поэтому половину оставшегося 90-го года НПК занимался сбором информации о сахарной свекле и осуществлял ряд технологических и технических разработок.
ДРОЖЖИ КАК ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ВЫСОКОАКТИВНАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА
В настоящее время из природы выделено несколько тысяч видов дрожжей и подобных их микроорганизмов. В хозяйственной деятельности человека используется лишь незначительная часть этой коллекции. Для нашей цели мы выбрали веками проверенные, прекрасно себя зарекомендовавшие и всем известные - пекарские дрожжи. Эти микроорганизмы достаточно высоко активные в автокаталитическом синтезе своей биомассы и хорошо растут на различных сахарах. Они содержат все незаменимые аминокислоты (их-девять), т.е. те, которые не синтезируются в организмах животных, группу витаминов, высококачественные белки, липиды и другие полезные вещества. Общее содержание белка в клетках пекарских дрожжей колеблется между 50 и 60 процентами (содержание белка определяется условиями выращивания). Пекарские дрожжи по своей пищевой и кормовой ценности значительно превосходят таковую у кормовых дрожжей, полученных из гидролизатов растительного сырья и из парафинов нефти, которые получили признание в комбикормовой промышленности. В силу того, что полезность, например, гидролизных дрожжей для животных уже ни у кого не вызывает сомнений, полезность пекарских дрожжей в этом случае доказательств не требует, т.к. это их свойство человеку давно известно и он ежедневно продолжает испытывает его на себе. Из различных информационных источников известно, что одна тонна кормовых дрожжей содержит около 6 кормовых единиц, т.е. их можно разбавлять в том или ином низкокачественном корме в 8 и более раз. Содержание же кормовых единиц в пекарских дрожжах нам неизвестно, но, учитывая их превосходство по содержанию белка и других веществ, кормовая ценность данной биомассы превосходит таковую у других дрожжей. Как отмечалось выше, некоторые сорта сахарной свеклы являются высокоурожайными. Из рекламных проспектов зарубежных фирм следует, что некоторые сорта дают 1500 ц/га с содержанием сахара в корнеплодах 15%. Следовательно, с одного гектара в данном случае можно получить 225 центнеров сахара. А из этого количества сахара можно, в свою очередь, произвести 170 т. сухих или 680ц прессованных пекарских дрожжей. Это количество дрожжей содержит 1400ц кормовых единиц, что в десятки и сотни раз превосходит заводов, производящих кормовые дрожжи из гидролизатов растительного мырья; установка показала свои высокие эксплуатационные качества с более высокой удельной производительностью по сравнению с известными; разработаны ряд способов приготовления и хранения кормовых смесей с использованием свекольно-дрожжевых добавок; прорабатывались варианты привязки опытного производства биотехнологической продукции к конкретному животноводческому хозяйству; приобретена по коммерческой цене электро компессорная установка Вильнюского завода-изготовителя; она является одним из главных "двигателей" биотехнологического процесса; совершены ряд поездок по свекло сеящим регионам Союза. В 1991 году организационно-технические работы и поиски высокоурожайных сортов сахарной свеклы. Как отмечалось выше, семена были найдены и приобретены. Они были высеяны в совхозе "Пятилетка": сорт Джамбульский многоростковый и два зарубежных-одноростковых. Джамбульский сорт оказался неустойчивым к заболеваниям и воздействию вредителей. В сентябре месяце начали сохнуть листья, в октябре - подгнивать кончики корнеплодов. Поэтому её пришлось выкопать. Урожай этой свеклы составил около 300ц/га. Импортные сорта, которые были высеяны в середине мая из-за задержек в процессе их приобретения, показали очень дружные всходы и активную вегетацию. В октябре месяце вес корнеплодов этих сортов достигал 2,5 кг с килограммовой ботвой. Никаких признаков заболевания растений или воздействия на них вредителей при этом не наблюдалось. Поскольку нам не был известен точный срок вегетации данных сортов, мы продолжали выращивание и наблюдения над ними. В ноябре месяце вес корнеплодов уже превышал 4 кг. В конце декабря вес корнеплодов был более 5 кг. При этом было замечено, что в тех местах, где расстояния между растениями 30 и немного более сантиметров, все корнеплоды были более крупные, а в местах загущаенных корнеплоды были более мелкими. Это указывает на то, что для получения высоких урожаев данных сортов необходимо соблюдать соответствующие нормы высева семян на единицу площади. По рекомендациям фирмы, производящей эти сорта, наиболее оптимальная норма составляет 60 тыс. семян на 1 га. Следовательно, при соблюдении всех агротехнологических и агротехнических требований к выращивания одноростковых импортных сортов сахарной свеклы её урожай на полевых землях составляет более 3000ц/га против 500ц/га на неполевых землях. По согласованию с нами, руководство о/х им. 5-летия УзССР, решило основную часть корнеплодов импортных семян оставить для дальнейшего их размножения. С нашей стороны имеются серьёзные сомнения в успехе этого дела, т.к. исходные семена были обработаны специальными препаратами, которые составляют секрет фирмы. Но, вероятно, данный замысел может дать положительный результат, если при этом применить весь комплекс защитных средств, над которым мы сейчас работаем. В силу того, что в 1990 году нам не удалось посеять семена сахарной свеклы, а 1991-ый год показал неожиданные результаты, программа работ, которая прикладывалась к договору от 24 мая 1990 года, по срокам её выполнения, сдвинулась на несколько месяцев (примерно до апреля месяца 1992 года). Мы считаем, что это не столь важно, т.к. получены такие результаты по урожаю свеклы, которые не могли быть предсказаны никем. А это стоит того, чтобы ускорить работы, минуя стадию лабораторно-опытных работ по выяснению конкретных данных о пользе сахарной свеклы и дрожжей, полученных из её углеводов. Тем более, что предварительные данные о влиянии дрожжевых добавок на ростовую активность животных нами уже получены. Летом прошлого года мы получили дрожжи, выращенные на гидролизных средах. Их качество, как отмечалось выше, уступает качеству пекарских дрожжей, выращенных даже на отходах сахарной промышленности - мелассе (патоке). Для этой цели в совхозе "Пятилетка" были взяты две группы свиней из тех, что поставлены на откорм. В опытной группе было 46 голов, а в контрольной - 50. Дрожжевые добавки производили в сухой комбикорм из расчёта 1г сухих дрожжей на 1 кг веса животного в сутки в течение месяца. Средний вес особи в опытной группе в начале эксперимента составлял 70кг, а в контрольной - 62кг. Через месяц средний вес в опытной группе был равен 91 кг, а в опытной - 78 кг. Таким образом опытное животное набрало за месяц в среднем 21 кг или 700г/сутки, а контрольное 16 кг или 530 г/сутки, или на 32% меньше.
Первому заместителю председателя кабинета министров при президенте республики Узбекистан И.Х. Джурабекову
Уважаемый Исмаил Хакимович!
Как Вам известно, научно-производственный кооператив "БИОСТАТ" главной своей деятельностью поставил разработку и внедрение БИОлогических СТАбильных Технологий - БИОСТАТ, -и, в частности, разработку биотехнологических способов производства кормов на основе соответствующей переработки сахарной свеклы. Работы над различными проблемами биотехнологии лично я веду с 1966 года. А с 1969 года. А с 1969 года мною были начаты публикации результатов своих исследований и защиту некоторых из них в виде патентов (авторских свидетельств СССР). Все мои научные публикации привлекли внимание учёных США, Канады, Англии, Италии, Франции, Германии, Японии и др. стран. Ряд из них внесены в каталог Лондонского информационного центра. Результаты моих научных исследований и изобретений также проходили всестороннюю экспертизу в Институте микробиологии АН СССР, во ВНИИГПЭ, ВНИИбиотехника, АН Молдавской ССР и затем были защищены диссертацией в Институте биофизики АН СССР и ВАКе СССР. В настоящее время этими и другими разработками владеет НПК "БИОСТАТ", в виде банка данных "ноу-хау". Последние наши разработки относятся к новейшим биотехнологиям кормопроизводства и агротехнологии производства стабильных и высоких урожаев сахарной свеклы, основанные на результатах собственных исследований и анализа мировой агротехнологии производства различных сортов сахарной свеклы и различным способам её переработки как в пищевой сахар, так и в корма. Но в любом случае работы нужно начинать с создания сырьевой базы, т.е. с приобретения семян высокоурожайных и высокосахаристых сортов свеклы, агротехнологий их возделывания и регинирации и т.д. На основе результатов анализа мировой практики свекловодства и кормопроизводства и с учётом личного опыта мы пришли к следующей схеме реализации решений по сахарным и кормовым проблемам, которая сводится к выполнению следующего комплекса работ:
1. Разработка организационно-технологического проекта производства сахарной свеклы. Проект будет включать в себя конкретные сорта сахарной свеклы, полный набор агротехнологических приёмов выращивания и защиты растений от болезней и вредителей, перечень техники для выполнений всех видов работ с почвой и свеклой от получения её семян до уборки корнеплодов и др.
2. Обеспечение Узбекистана семенами высокоурожайных сортов сахарной свеклы с приложением агротехнологий их возделывания в конкретных условиях.
3. Разработка проекта кормопроизводства на будущих сахарных заводах Узбекистана.
4. Практическая отработка биотехнологий кормопроизводства на основе сахарной свеклы.
5. Организация учебных курсов по агротехнологии производства сахарной свеклы и различным способам её переработки.
Пункты 1-4 можно выполнить за 24 месяца начиная с октября с.г. одновременно в нескольких областях Узбекистана. Полную окупаемость затрат под урожай сахарной свеклы в 1994 году можно получить в том же году после сбора урожая. Но, как утверждают экономические законы, прибыль получается только после инвестиций. На основании вышеизложенного и остроты сахарного и кормового дефицитов в Узбекистане, прошу Вас, Исмаил Хакимович, оказать содействие НПК "БИОСТАТ" в получении льготного кредита под п.п. 1-4 в размере 8 млн. руб. или эквивалентного количества СКВ сроком до трёх лет. Учитывая же большую скорость роста цен на семена сахарной свеклы, их приобретение нужно осуществить уже в сентябре - октябре 93-го года. Всю ответственность за последствия НПК "БИОСТАТ" полностью берёт на себя.
Председатель НПК "БИОСТАТ" кандидат биол. наук Н.В, Золотухин 5 сентября 1993г.
Адрес: 700015, г. Ташкент, ул. Рабочая 24, Золотухину Николаю Васильевичу.
"УТВЕРЖДАЮ" "УТВЕРЖДАЮ"
Генеральный директор Главный инженер Янгиюльского
УзНПО "Кибернетика" АН УзССР биохимического завода
В.К. Кабулов Зырянов В.Н.
17 декабря 1982г. 16 декабря 1982г.
АКТ
технических испытаний "Аппарата для выращивания микроорганизмов" по авт.св. СССР №753894
Мы, нижеподписавшиеся представители УзНПО "КИБЕРНЕТИКА" АН УзССР зав. НПК, к.т.н. Ахметов, зав. лабораторией, к.т.н. Якубов Э.М., ст.научный сотрудник, к.б.н. Золотухин Н.В., мл.научный сотрудник Юлдашев А.В., ст.инженер, к.б.н. Исмаилов А.У. и представители Янгиюльского биохимического завода начальник ПТО Шакиров Г.К. главный технолог дрожжевого цеха Мальцева В.И. составили настоящий акт в том, что силами УзНПО "КИБЕРНЕТИКА" и СМНУ "Средазмикробиопрома" на Янгиюльском биохимическом заводе в 1981-82 гг были изготовлены и затем испытаны аппараты для выращивания микроорганизмов ёмкостью 1,2 и 50 м3. Малый аппарат после успешных испытаний в настоящее время в течение 4-х месяцев работает в качестве регенератора чистой культуры. Аппарат ёмкостью 50 м3 имеет следующие технические характеристики:
- высота - 5м,
- диаметр - 4м,
- количество перфорированных дисков - 3 шт,
- общая площадь перфорации - 35%,
- общий вес- около 5 т.
Многократные испытания аппарата ёмкостью 50 м3 показали, что при надлежащем контроле и корректировке технологических параметров работа способность его аналогична работа способности малого. Прямые наблюдения и измерения основных технологических параметров микро биосинтеза в аппарате с перфорированной системой воздухораспределения при использовании для его работы промышленных сред и штаммов микроорганизмов дали следующие результаты:
- микробиологическое состояние дрожжевых культур при их непрерывном росте - хорошее,
- выход дрожжей с единицы РВ составил - 45-50%,
- абсолютная влажность дрожжей составила 70%,
- температурный режим в аппарате поддерживался без использования внутри него теплообменных устройств,
- расход воздуха на 1 м3 микробной культуры составил 10-15 м3/ч коэффициент наполнений аппарата достигал 60%,
-производительность аппарата по дрожжам при концентрации РВ в приточном сусле 0,8% достигала 35кг/час.
Таким образом, результаты данных испытаний показывают перспективность предложенной конструкции аппарата и, вероятно, требуют дальнейших исследований по созданию крупнотоннажных образцов. Поэтому данный аппарат требует дальнейшей конструктивной доработки и соответствующего технологического обеспечения.
Ахметов К.А. Шакиров Г.К.
Якубов Э.М. Шабаева Л.А.
Золотухин Н.В. Миронов В.В.
Юлдашев А.В. Мальцева В.И.
Исмаилов А.У
"УТВЕРЖДАЮ"
Зам.директора Янгиюльского
биохимического завода
__________ Курилко М.Д.
"___"_________1980г.
АКТ
испытания "Способа получения биомассы", разработанного институтом кибернетики с ВЦ АН УзССР и Янгиюльским биохимическим заводом главного управления микробиологической промышленности при СМ СССР.
В 1979 году на Янгиюльском биохимическом заводе испытывали способ получения биомассы дрожжей, культивируемых на гидролизных средах. Дрожжи выращивали в установке, содержащей плоские и трубчатые перфо элементы, при помощи которых регулировали общий объём воздушных пузырьков, проходящих сквозь культуральную жидкость. В ходе испытаний было установлено, что пененее среды определяется объёмом газовых пузырьков в культуральной жидкости и концентрацией дрожжей, находящихся в ней. При этом с ростом концентрации дрожжей в среде линейно необходимо увеличивать и общий объём газовых пузырьков. В периодическом и непрерывном режимах выращивания дрожжей в условиях Янгиюльского завода по данному способу на пеногашение практически никаких затрат не производили, кроме как на регуляцию объёма воздуха, находящегося в виде отдельных пузырьков в жидкой среде. Дрожжи при этом сохраняли примерно одинаковую скорость роста, а производительность аппарата была стабильной. Исходя из существующих норм затрат на пеногашение, данный способ позволяет снизить себестоимость дрожжей до 20 руб. на 1т. Данные, полученные нами в этом эксперименте, сопоставимы с данными многих авторов, проводивших подобные работы с различными животными, включая и свиней. Из их публикаций следует, что дрожжевые добавки в основные корма увеличивают привесы на 25% и более. Таким образом, результаты, полученные нами по свекле и влиянию кормовых дрожжей (их добавок в основной корм) на рост животных (привесы), дают твёрдую основу для необходимости продолжения работ по развитию нетрадиционных способов кормопроизводства.
ВЫВОДЫ
1. Сахарная свекла на данный период времени является мощным источником сырья для получения и резкого увеличения объёмов высококачественных кормов для сельхозживотных. Это особенно ценно для Республики Узбекистан, в которой площади под кормовые культуры сильно ограничены.
2. Многолетние и многочисленные работы разных авторов по выяснению влияния дрожжевых добавок в основные корма на продуктивность всего набора животных, используемых человеком в своей хозяйственной деятельности и получаемые при этом положительные результаты, а также предварительные данные по этому вопросу, полученные нами, указывают на следующее. Кормовой дефицит уже в ближайшие годы можно устранить путём оперативного строительства мини и макро заводов по переработке сахарной свеклы в физиологически высокоактивные кормовые добавки. При этом может быть использована часть оборудования сахарных заводов.
3. Для успешного продвижения в данном направлении необходимо выделить материальные и финансовые средства, в таком количестве, которое потребует создание завода с заданной производительностью. А для начала необходимо построить опытный цех по производству кормовых добавок из сахарной свеклы в количестве, необходимом для удовлетворения потребностей всего поголовья животных одного из хозяйств.
Кандидат биологических наук Н.В. Золотухин 26.01.1992г.
АКТ
Опытное хозяйство им. 5-ти летия УзССР "31" января 1992 года
Научно-производственный кооператив "БИОСТАТ" в лице его директора кан.биол.наук Н.В. Золотухина, с одной стороны и опытное хозяйство им. 5-ти летия УзССР в лице гл. зоотехника хозяйства М.И.Ахмедова и бригадира свинофермы Н.М. Глуховцевой, с другой стороны, составили настоящий Акт о том, что доставленные НПК "БИОСТАТ" в с/х гидролизные дрожжи были использованы в кормовых рационах свиней. В течение одного месяца опытной группе животных (46 голов) в их кормовой рацион добавились указанные дрожжи из расчёта 1г. на 1кг. веса животных в сутки. Средний вес животного в опытной группе возрос с 70 до 91 кг, а в контрольной группе (50 голов) с 62 до 78 кг., т.е. среднесуточный привес в опытной группе составил 700г., а в контрольной -530 г.
Директор НПК Н.В. Золотухин гл.зоотехник хоз-ва М.И. Ахмедова бригадир фермы Н.М.Глуховцева
ПЕРВОМУ СЕКРЕТАРЮ ЦК КОМПАРТИИ УЗБЕКИСТАНА тов. И.А.КАРИМОВУ
Уважаемый Ислам Абдуганиевич!
Предлагаемая при этом программа "БИОСТАТ" по решению кормовой и продовольственной проблем является результатом моей научной работы (с 1966 года) над проблемами управления процессами жизнедеятельности нормально растущих живых клеток. Они в основном являются пионерскими и поэтому мировых аналогов не имеют. Полученные научные результаты, как я убедился в последствии, имеют большой практический интерес. Реальность практической значимости результатов моей работы была проверена в условиях промышленного производства кормового белка и агросекторе. Результаты получились - впечатляющие! Учитывая то, что, помимо острого кормового дефицита, в республике существует дефицит и сельхозплощадей, предлагаемый мною вариант решений кормовой и продовольственной проблем можно рассматривать как двойную альтернативу традиционным способам кормопроизводства. По ним, как известно, усиление кормовой ценности фуража достигается за счёт добавок, например, сои, гороха и др. культур, урожайность которых относительно низка. По предлагаемой программе исключается экстенсивность и одновременно резко повышается отдача земельных площадей. Кроме того, создаётся основа для планомерного решения проблемы обеспечения населения мясомолочными и другими продуктами собственного производства. В связи с вышеизложенным и положениями прилагаемой программы "БИОСТАТ", прошу Вашего содействия в обеспечении научно-производственному кооперативу "БИОСТАТ" "зелёной улицы".
Председатель НПК "БИОСТАТ" к.б.н. Н.В.Золотухин
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КООПЕРАТИВ "БИОСТАТ"
700015, ТАШКЕНТ, УЛ. РАБОЧАЯ 24, Т.753-450
ПРЕЗИДЕНТУ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН И.А. КАРИМОВУ
Уважаемый Ислам Абдуганиевич!
Обращаюсь к Вам потому, что на нижних уровнях всякой власти, вопросы, связанные с кардинальными решениями кормовой проблемы, полученные и предлагаемые научно-производственным кооперативом "Биостат", решаются крайне тяжело и медленно. По нашему глубокому убеждению, без кардинального решения кормовой проблемы, ни о каких крупномасштабных продовольственных программах и речи не может быть. При этом в решение кормовой проблемы мы вкладываем всё, что связано с получением высоких и устойчивых урожаев источников кормов и стабилизацией высокой продуктивности сельскохозяйственных животных за счёт гарантированного кормового рациона, сбалансированного по всем физиологическим показателям. Иными словами, весь комплекс кормопроизводства должен быть поставлен на научную основу. Как показывает вся мировая практика и история хозяйственной деятельности людей, успехи во всех аграрных секторах имеются там, где поддерживается высокое плодородие земли, достигнуты высокие и стабильные урожаи растительных культур, создана оптимальная кормовая база, выращиваются и содержатся высокопродуктивные генотипы животных, не знающих полуголодного или голодного периодов своего существования. НПК "Биостат" располагает собственной наукоёмкой биотехнологией получения высококачественных кормов в требуемом количестве. Она основана на получении высоких (более 1000 ц/га) урожаев сахарной свеклы с последующей её переработкой в высокоактивные физиологические продукты. В 1991 году мы уже получили свыше 2000 ц/га сахарной свеклы или в пересчёте на сахар - свыше 300ц/га. Такой урожай нам показали югославские сорта одноростковой сахарной свеклы. Посев семян произвели в опытном хозяйстве им. 5-ти летия УзССР. Этот урожай сахарной свеклы эквивалентен 3000 ц кормовой свеклы, которые можно получить на 15-20 га земли. Сахарная же свекла по нашей биотехнологии будет перерабатываться в концентрированные, высокоактивные биологические добавки основным компонентом которых будут пекарские дрожжи. Последние значительно превосходят уже известные кормовые дрожжи. Последние значительно превосходят уже известные кормовые дрожжи, производство которых по ряду причин будет оставаться незначительным. Производство же биотехнологической продукции из сахарной свеклы можно наладить в требуемом количестве. В комплексе с данным производством можно развивать и сахарную промышленность. В опытном хозяйстве им. 5-ти летия УзССР нами были проведены работы по влиянию дрожжевых добавок на продуктивность (привесы) животных. Оказалось, что дрожжевые добавки из расчёта 1 гр. дрожжей на 1 кг веса животного в сутки увеличивают скорость прироста массы животного на 30%. Иными словами, заданный конечный вес животного можно достичь почти на одну треть ( по времени) быстрее, чем без дрожжевых добавок. Например, если исходный вес группы животных равен 100 т и через месяц в обычных условиях кормления он увеличивается до 115 т, то этот же вес при дрожжевых добавках возрастает до 121 т, т.е. при этом получается 6000 кг дополнительного мяса. Или во временном измерении: если для достижения заданного веса в обычных условиях требуется 12 мес., то с добавлением биотехнологической продукции для этого потребуется 8 мес. Иными словами, за два года вместо 2-х кондиционных групп животных можно получить три таких же группы. Эти результаты дают наглядное преимущество использования биотехнологии в кормопроизводстве с применением высокоурожайных сортов сахарной свеклы. Ниже прилагается фрагмент из программы "Биостат", относящийся к решению кормовой и мясо-молочной проблем. Он складывается не из отдельных решений частных вопросов, а основан на "объёмном" восприятии и решении всего комплекса агротехнологических и кормо производственных задач.
Председатель НПК "БИОСТАТ" Н.В.Золотухин
Ответ на письмо президенту.
ПРЕДСЕДАТЕЛЮ НПК"БИОСТАТ" т. ЗОЛОТУХИНУ Н.В.
13.03.1992г.
11/21-040
На письмо научно-производственного кооператива "Биостат" тов. Золотухина Н.В.
Председатель НПК "Биостат" Золотухин Н.В. безусловно поднимает вопрос актуальный. Узбекистан (Ташкентская область) в своё время засевал сахарной свеклой значительные площади, а в последующие годы в Ташкентской области стабильно засевалось 3400 га под полусахарную свеклу на корм скоту, соответственно урожайность в среднем составляла 410 ц/га, 360 ц/га, 361 ц/га. В отдельных хозяйствах Средне-Чирчикского района (колхоз "Ленин-Юли" урожайность достигала 838 ц/га (сорт узбекская полусахарная), в Чиназском районе ( колхоз "Победа") 1185 ц/га. Ранее действовавшие сахарные заводы, к примеру, в Янгиюле и Ташкенте ("Уртак") были ликвидированы.
Золотухин Н.В. в 1991г. в совхозе "Пятилетка" Галабинского района посадил 0,5 га Югославский гибрид сахарной свеклы "Тима" и "Амена". Это не производственные испытания. Полученные клубни были оставлены на размножение в 1992 году. Какие площади будут засеяны в 1993 году сказать трудно, так как из-за малой семено урожайности гибриды размножать трудно.
Вопрос о более ускоренном увеличении посевных площадей сахарной свеклы Югославских гибридов, требующих от 60 до 120 тыс. семян на 1 га возможно решить приобретением семян в Югославии за СКВ, где потребуется примерно 75 долларов на 1 гектар.
Вопрос получения Узбекистанского сахара, восстановления и строительства сахарных заводов лежит в некомпетенции Ташоблагропромсоюза.
Председатель Нурматов Р.Н.
ПРЕДСЕДАТЕЛЮ СОВЕТА МИНИСТРОВ
ПРЕДСЕДАТЕЛЮ СОВЕТА МИНИСТРОВ УзССР
тов. МИРКАСЫМОВУ М.М.
Уважаемый Мирахмат Мирахмедович!
Прилагаемая при этом программа "БИОСТАТ" по решению кормовой и продовольственной проблем на основе новейших биотехнологий частично уже обсуждалась с тов. И.Х.Джурабековым, В.М.Богриным, Н.И.Гусаковым, Б.М.Жердевым и рядом руководителей животноводческих хозяйств.
Реальность и эффективность предлагаемых решений особых сомнений ни у кого из них не вызвали. Тем более, что все эти решения многократно апробировались в различных условиях. Учитывая то, что помимо острого кормового дефицита (не говоря о продуктах), в Республике существует и дефицит сельхозугодий, предлагаемый вариант можно рассматривать как двойную альтернативу традиционным способам кормопроизводства. По ним, как известно, усиление ценности кормов достигается за счёт добавок сои, гороха и других культур, урожайность которых относительно низка.
По предлагаемой программе исключается экстенсивность и одновременно резко повышается отдача земельных площадей. Кроме того, создаётся реальная основа для планомерного решения проблемы обеспечения населения мясомолочными и другими продуктами собственного производства.
С учётом вышеизложенного и прилагаемой программы "БИОСТАТ", прошу вашего содействия в обеспечений практической реализации имеющихся решений, т.е. выделить НПК "БИОСТАТ" беспроцентную ссуду на 5 лет за счёт оборотных средств или других источников.
Председатель научно-производственного кооператива "БИОСТАТ", к.б.н. Н.В. Золотухин
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КООПЕРАТИВ "БИОСТАТ"
700015, Ташкент, ул. Рабочая 24
ПЕРВОМУ ЗАМЕСТИТЕЛЮ ПРЕДСЕДАТЕЛЯ КАБИНЕТА МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН И.Х.ДЖУРАБЕКОВУ
Уважаемый Исмаил Хакимович!
НПК "БИОСТАТ" начал и ведёт работы по практической реализации своей программы. По состоянию работ на октябрь с.г. имеются следующие результаты и перспективные решения:
1. Приобретены и посеяны семена 3-х сортов сахарной свеклы. Из них - 2 импортных, одноростковых, высокоурожайных (до 1500 и более центнеров с гектара). Импортные имеют мощный ростовой процесс корнеплодов, а отечественный сорт значительно отстаёт. Ожидается урожай импортных сортов свыше 1500 ц/га. Это значит, что, после биотехнологической переработки урожая свеклы можно получить свыше 1500 ц кормовых единиц с гектара земли.
2. НПК располагает возможностями внедрения в республике новейших агротехнологий возделывания и уборки высокоурожайных сортов сахарной свеклы, полностью исключающих ручной труд, за исключением труда механизаторов.
3. Практически решена проблема балансировки кормов по углеводам для дойного стада.
4. По научным и техническим решениям, имеющимся в НПК, найдена реальная возможность создания в Республике такой кормо производящей базы, которая сможет полностью обеспечить всех сельхозживотных полноценными кормами.
Для реализации вышеперечисленных работ необходимо:
- изыскать материальные ресурсы (хлопок, шрот и др.) для бартерного обмена их на машины и оборудование по возделыванию и уборке сахарной свеклы с последующей её заводской переработкой в корма,
- выделить финансы на освоение агротехнологии возделывания высокоурожайных сортов сахарной свеклы, проектирования и строительства опытного завода уже в этом году.
Прошу рассмотреть и положительно решить экономические вопросы по реализации программы "БИОСТАТ", например, в масштабах одного района.
Председатель НПК "БИОСТАТ" кандидат биол. наук 08.10.1991г. Н.В.Золотухин
ПРОГРАММА "БИОСТАТ"
Основана на использовании информации о пространственной, структурно - функциональной и временной организации клеточно - молекулярных процессах и работе механизмов регуляции направленности автокаталитического (внутриклеточного) синтеза различных биоорганических соединений (аминокислот, коферментов, нуклеотидов, белков и др. физиологически высокоактивных биологических веществ). Такой комплексный подход к пониманию и исследованию биопроцессов на молекулярном уровне открывает перспективу резкого повышения эффективности различных биотехнологий. Программа "БИОСТАТ" предусматривает решения ряда биотехнологических проблем, включая и проблемы промышленной биоиндустрии. Одной из них, в частности, является проблема: "Разработка и освоение на промышленном уровне малоотходной биотехнологии производства дрожжей из углеводов растительного сырья". Решения данной проблемы преследует следующие цели:
- стабилизировать содержание протеина в дрожжевой массе на уровне 50% и более,
- сократить потери дрожжей и повысить выход готовой продукции на 10-15%,
- сократить объём сточных вод в 2 раза и более и улучшить их качество,
- снизить в 2-4 раза энерго и металлоёмкость дрожжевого производства.
Ожидаемый экономический эффект:
- снижение себестоимости производства 1 тонны дрожжей на 25-30 рублей
ЭТАПЫ РАБОТ
1. Разработать, изготовить и освоить интенсивную систему аэрации культуры кормовых дрожжей в аппарате ёмкостью 320 м3.
2. Разработать и отработать уточнённый биотехнологический регламент в условиях интенсивной аэрации дрожжевой культуры.
3. Разработать и реализовать укороченную схему производства дрожжей из углеводов растительного сырья.
4. Разработать и реализовать на промышленном уровне малоотходную биотехнологию производства дрожжей из углеводного сырья.
5. Организовать и произвести повышение квалификации персонала, обслуживающего дрожжевое производство.
Время реализации программы по дрожжевому производству 1-1,5 года.
Ориентировочные затраты 100-150 тыс.руб.
Кандидат биологических наук, председатель НПК "БИОСТАТ" Н.В. Золотухин
СМЕТА
затрат по 1 этапу: "Разработать, изготовить и освоить интенсивную систему аэрации культуры кормовых дрожжей в аппарате ёмкостью 320 м3 ".
№№ Статьи расхода Объём затрат
п/п %% руб.
1. Приборы, оборудование и хоз. инвентарь 18 3600
2. Аренда служебных помещений 12 2400
3. Отчисления в соц. страх 7 1400
4. Заработная плата 50 10000
5. Накладные расходы 23 4600
Итого 20000
От исполнителя: Н.В. Золотухин
Тема: "Разработка и освоение малоотходной биотехнологии производства дрожжей из углеводов /гидролизатов/ растительного сырья"
1-й этап. Разработать, изготовить и освоить систему интенсивной аэрации дрожжевой культуры в аппарате ёмкостью 320 м3.
2-й этап. Разработать и освоить способ выращивания дрожжей с использованием питательной среды, содержащей на 30% больше сахаров, чем по действующему технологическому регламенту.
3-й этап. Разработать и освоить способ производства кормовых дрожжей, по которому показатели ХПК и БПК снизятся на 50% против имеющихся, к моменту действия договора, в производстве.
ОЖИДАЕМЫЙ ЭКОНОМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ - не менее 50 тыс.руб. в год.
Условия для выполнения работ
1. Заказчик выдаёт исполнителю официальные данные по следующим показателям дрожжевого производства:
- среднесуточные, среднегодовые объёмы сточных вод в дрожжевом производстве.
- среднемесячные потери /уносы в канализацию/ основного сырья /РВ/ и целевого продукта/дрожжей/.
- среднесуточную и среднемесячную производительность дрожжевой линии.
- усреднённые показатели ХПК и БПК за сутки и по месяцам в течение последнего года на момент начала действия договора.
- текущие данные по выходу готовой продукции и содержанию в ней белка.
2. Заказчик обеспечивает материальными и людскими ресурсами выполнение технического и технологического проекта исполнителя.
3. Заказчик обязуется не передавать третьей стороне техническую и технологическую информацию, полученную им от исполнителя. В противном случае он несёт материальную ответственность за ущерб, нанесённый при этом исполнителю.
4. После получения предварительного положительного эффекта по одному или нескольким основным показателям производства, заказчик переводит на счёт исполнителя 20000 руб. в качестве аванса.
5. Окончательный расчёт производится из расчёта 70% от годового экономического эффекта за первый год и по 25% за два последующие годы, включая и аванс.
Материально-технические ресурсы, необходимые для выполнения по теме:
"Разработка и освоение на промышленном уровне (в аппарате ёмкостью 320 куб.метров) малоотходной биотехнологии производства кормовых дрожжей из углеводов (гидролизатов) растительного сырья".
1. Сталь 3 листовая, толщиной 3 мм. около 1 т (38 м2).
2. Полоса 3х30 -72 п.м.
3. Уголок 50х50 - 30 п.м.
КИП и А
1. Система регистрации и регулирования рН аммиач. водой
2. Система регистрации и регулирования температуры.
3. Система регистрации и регулирования потока питат. среды.
4. Система регистрации расхода воздуха.
5. Система регистрации уровня жидкости в аппарате.
АКТ
Опытное хозяйство им. 5-ти летия УзССР "31" января 1992 года
Научно - производственный кооператив "БИОСТАТ" в лице его директора канд. биол. наук Н.В.Золотухина и ведущего специалиста Жемчуг Д.Ф., с одной стороны, и опытное хозяйство им. 5-летия УзССР в лице его директора С.К. Султанбекова и гл. агронома Э.И. Катаманова, с другой стороны, составили настоящий Акт о том, что приобретённые НПК "БИОСТАТ" импортные семена одноростковых сортов сахарной свеклы Ал. тима и Ал. амона были высеяны в Опытном хозяйстве. За 210 дней вегетации корнеплоды данных сортов сах. свеклы достигли веса 4-6 кг, что соответствует урожайности 240-300 т/га при норме высева 60 тыс. семян на 1га.
Директор НПК Н.В.Золотухин ведущий специалист Д.Ф.Жемчуг
Директор опытного хозяйства С.К. Султанбеков гл.агроном З.И.Катаманов
"УТВЕРЖДАЮ"
Гл. инженер Краснодарского
химического комбината
А.Г. Афанасьев
"18" января 1989г.
АКТ
технических испытаний перфорированной системы аэрации дрожжевой культуры, выполненной по эскизному проекту к.б.н. Н.В. Золотухина в соответствии с трудовым соглашением от 12.12.88 года.
Мы, представители "Заказчика", нач. дрожжевого участка КХК А.В. Бондарев, химик-микробиолог Л.Г.Карпович и механик А.И.Каплер, с одной стороны, и к.б.н. Н.В.Золотухин - "Исполнитель", с другой стороны, составили настоящий акт о том, что, после изготовления силами дрожжевого участка перфорированной системы аэрации дрожжевой культуры по эскизному проекту, предложенному "Исполнителем", были проведены её испытания в промышленных условиях. В ходе данных испытаний были получены следующие результаты:
1. Экспериментально показана возможность увеличения рабочего объёма /коэффициента наполнения/ дрожжево растительного аппарата с 6 м3 /по действующему регламенту/ до 12 м3 и, тем самым, увеличить соответственно в 2 раза удельную производительность аппарата.
2. Экспериментально также установлено, что испытанная система аэрации имеет определённые потенциальные возможности и для более полного раскрытия, требует своего дальнейшего совершенствования. Данную работу целесообразно проводить в рамках временных творческих коллективов на материально-технической базе КХК.
Новая система аэрации микробных культур смонтирована и испытана в инокуляторе №2 дрожжевого участка КХК.
От "Заказчика": От "Исполнителя"
А.В.Бондарев к.б.н. Н.В.Золотухин
Л.Г.Карпович
А.И.Каплер
"УТВЕРЖДАЮ"
Главный инженер Янгиюльского
биохимического завода /ЗыряновВ.Н./
" " 1979 года
АКТ
Испытания аппарата для выращивания микроорганизмов, разработанного институтом кибернетики с ВЦ АН УзССР совместно с Янгиюльским биохимическим заводом.
В течении 1978-79 гг на Янгиюльском биохимическом заводе испытывался аппарат для выращивания микроорганизмов следующей конструкции. Аппарат представляет собой вертикальную цилиндрическую ёмкость с коническим днищем. Под днищем аппарата установлена камера для предварительного смешивания среды с воздухом. На меньшем основании днища над камерой и большим основанием над борбатером укреплены перфорированные перегородки. В цилиндрической части аппарата установлены перфорированные диски с кольцевым зазором относительно стенок ёмкости. Аппарат изготовлен из нержавеющей стали и имеет общую ёмкость 1100 л. При испытании аппарата были использованы производственные гидролизные среды и штаммы микроорганизмов. Процесс выращивания микроорганизмов проводился в периодическом и непрерывном режимах. В течение многосуточных экспериментов в аппарате устойчиво поддерживался объём рабочей суспензии микроорганизмов на уровне 1050-1060 л и заданные концентрации дрожжей и компонентов питательной среды. Пенообразование практически не имело места. Это послужило основой для увеличения удельной производительности аппарата в 3 раза против существующих норм. Выход дрожжей с единицы сахаров колебался в пределах 40-60%.
Нач. дрожжевого цеха /Скрипкин С.С./
Механик цеха /Шакиров У.К./
"УТВЕРЖДАЮ"
Зам. генерального директора УзНПО "КИБЕРНЕТИКА"
Н.А.Муминов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
о новизне, существенных отличиях и положительном эффекте изобретения "Способ выращивания микроорганизмов"
Заявитель: Институт кибернетики с ВЦ АН УзССР
Авторы: Золотухин Н.В., Якубов Э.И., Ахметов К.А.
Предложен способ выращивания микроорганизмов, по которому, с целью стабилизации концентрации азотсодержащих веществ в синтезируемой биомассе, процесс ведут при концентрации аммиака 100-200 мг на 1 гр. сухой биомассы культивируемых микроорганизмов. Известные способы выращивания микроорганизмов также преследуют цель повышения качества биомассы, которую достигает либо путём регулирования качества биомассы, которую достигают либо путём регулирования качества процесса регенерации клеток, либо путём совместного выращивания качества процесса регенерации клеток, либо путём совместного выращивания нескольких видов микроорганизмов. Кроме того, известен также способ выращивания микроорганизмов, по которому процесс оптимизируют за счёт регулирования подачи субстрата в зависимости от его расхода и расхода аммиака. Предлагаемый способ, наряду с регулированием подачи субстрата и аммиака в аппарат, предусматривает также и регулирование концентрации аммиака непосредственно в среде в зависимости от концентрации в ней микроорганизмов. Именно последнее и является отличительным признаком предлагаемого способа от известных. Поддержание в среде "насыщающих" количеств источника азота практически для любого количества микробных клеток в рабочем объёме действительно может не ограничивать синтезы клеточных компонентов, в которых аммиак является одним из исходных реагентов (синтезы белков, аминокислот, нуклеотидов и др.). В силу этого по данному способу можно стабилизировать данные процессы и концентрацию азотсодержащих веществ в синтезируемой биомассе. Применение данного способа, например, в производстве кормовых и пищевых дрожжей явится основой для повышения их качества и снизит затраты на повышение содержания в них белка примерно на 15-20 руб. за 1 т.
Простота способа позволяет внедрить его в весьма короткие сроки. Публикация сущности способа в открытой печати - нецелесообразна.
Эксперты: д.т.н. Т.Ф. Бекмуратов к.т.н. Е.В.Квашин
Иркутский 700015, Ташкент, ул.Рабочая, 24
научно-исследовательский Золотухину Н.В.
и конструкторский институт
химического машиностроения
ИРКУТСКНИИХИММАШ
664074, Иркутск-74
ул. акад. Курчатова, 3
Расчётный счёт 00264612
в транспортном отд.
Промстрой банка
25-04-88 №03-10-110-1764
Уважаемый т. Золотухин Н.В. !
Ваше письмо от 07.04.88г. вызывает определённый интерес по специализации ИркутскНИИхиммаша в направлении ферментеро строения для производства дрожжей из гидролизатов растительного сырья. Для детального обсуждения технической стороны вопроса желателен Ваш приезд в ИркутскНИИхиммаш с предварительным сообщением срока прибытия для бронирования Вам гостиницы.
С уважением
Зам. директора по научной работе
Доктор техн. наук А.М.Кузнецов
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КООПЕРАТИВ "БИОСТАТ"
700015, Ташкент, ул. Рабочая, 24
ПЕРВОМУ ЗАМЕСТИТЕЛЮ ПРЕДСЕДАТЕЛЯ КАБИНЕТА МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН И.Х.ДЖУРАБЕКОВУ
Уважаемый Исмаил Хакимович!
НПК "БИОСТАТ" начал и ведёт работы по практической реализации своей программы. По состоянию работ на октябрь с.г. имеются следующие результаты и перспективные решения:
1. Приобретены и посеяны семена 3-х сортов сахарной свеклы. Из них - 2 импортных, одноростковых, высокоурожайных (до 1500 и более центнеров с гектара). Импортные имеют мощный ростовой процесс корнеплодов, а отечественный сорт значительно отстаёт. Ожидается урожай импортных сортов свыше 1500 ц/га. Это значит, что, после биотехнологической переработки урожая свеклы можно получить свыше 1500 ц кормовых единиц с гектара земли.
2. НПК располагает возможностями внедрения в республике новейших агротехнологий возделывания и уборки высокоурожайных сортов сахарной свеклы, полностью исключающих ручной труд, за исключением труда механизаторов.
3. Практически решена проблема балансировки кормов по углеводам для дойного стада.
4. По научным и техническим решениям, имеющимся в НПК, найдена реальная возможность создания в республике такой кормо производящей базы, которая сможет полностью обеспечить всех сельхозживотных полноценными кормами.
Для реализации вышеперечисленных работ необходимо:
- изыскать материальные ресурсы (хлопок, шрот и др.) для бартерного обмена их на машины и оборудование по возделыванию и уборке сахарной свеклы с последующей её заводской переработкой в корма,
- выделить финансы на освоение агротехнологии возделывания высокоурожайных сортов сахарной свеклы, проектирования и строительства опытного завода уже в этом году.
Прошу рассмотреть и положительно решить экономические вопросы по реализации программы "БИОСТАТ", например, в масштабах одного района.
Председатель НПК "Биостат" кандидат биол. наук Н.В.Золотухин 08.10.1991 год.
О ВНЕДРЕНИИ ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ В ПРОИЗВОДСТВО
Как показывают результаты работ различных лабораторий, основным препятствием во внедрении водородных бактерий в производство является ряд технологических вопросов, касающихся управления их газовым питанием. Опыт работы группы водородного биосинтеза института ВНИИбиотехника показал, что данный вопрос уже поддаётся решению не только в литровых, но и кубовых объёмах, культуральной среды, т.к. при переходе от малых объёмов к большим сам биологический процесс не меняется. Но при данном переходе меняется характер технических задач. Кроме того, как показывают результаты работ различных отечественных лабораторий, для культивирования водородокисляющих бактерий в больших объёмах принципиально новых ферментеров создавать не нужно. Для этой цели вполне пригодны уже существующие ферментеры для выращивания дрожжей и других микробов.
Поэтому, исходя из вышеизложенного, уже в 1974 году организовать на одном из заводов главмикробиопрома производство водородных бактерий в таком количестве, которое необходимо для испытания их биомассы на различных животных. Экспериментальные данные показывают, что для получения нескольких тонн сухой массы бактерий, в перспективе - работы по регулированию микробиосинтеза путём контроля внутриклеточных процессов и управления ими. Эти работы, как показывает опыт, крайне необходимы для создания эффективных систем управления микробиологическим процессом.
29.05.73 Н.Золотухин
18 марта 1991г. ЗАМ.ПРЕДСЕДАТЕЛЯ ДЖАМБУЛЬСКОГО ОБЛАСТНОГО АГРОПРОМЫШЛЕННОГО КОМИТЕТА
В одном из хозяйств Ташкентской области в текущем году научно-производственным кооперативом "БИОСТАТ" (организован в прошлом году содействии совмина УзССР) планируется создание опытного производства полноценных кормовых смесей на основе применения новейших биотехнологий, разработанных самим НПК. Исходным сырьём в данном производстве будет служить сахарная свекла. Но, как известно, в Узбекистане сахарная свекла не культивируется и поэтому республика не располагает её семенами. В связи с вышеизложенным, прошу сказать нам содействие в приобретении семян сахарной свеклы.
Председатель НПК "БИОСТАТ" кандидат биол. наук Н.В.Золотухин
Председателю Фрунзенского Райисполкома г. Ташкента Ш.Т. Нусратову
Объяснительная записка
Научно-производственный кооператив "Биостат", зарегистрированный 25.01.90г., не производит выплату налогов с результатов своей деятельности потому, что:
1. К настоящему времени он ещё не имеет собственных основных и оборотных средств. Свою деятельность НПК "Биостат" сейчас осуществляет за счёт долгосрочной ссуды, предоставленной ему Минсельхозом Республики Узбекистан. Деятельность НПК заключается в том, что он ведёт научные и технические разработки основ для создания в Республики новой отрасли кормопроизводства с использованием сахарной свеклы.
2. НПК "БИОСТАТ" имеет собственную рабочую программу, принятую правительством республики и рекомендованной им к практической реализации. Она состоит из 3-х этапов:
- поиски и приобретение семян высокоурожайных сортов сахарной свеклы с целью их дальнейшего размножения для культивирования этих корнеплодов в животноводческих хозяйствах республики и использования в экспериментальных работах НПК; внедрение интенсивных агротехнологий культивирования сахарной свеклы на полевых землях; срок выполнения работ 1990-92гг.;
- разработка и опытная проверка новых биотехнологий переработки сахарной свеклы в высокоактивные кормовые добавки, срок выполнения 1990-92гг;
- участие в организации и осуществлении строительства опытного сахарно-кормового завода: 1993-94 гг.
После широкого распространения высокоурожайных сортов сахарной свеклы по хозяйствам Узбекистана и вывода опытного завода на стадию рентабельности НПК "Биостат" будет получать деведенды в виде отчислений от прибыли свекло сеящих хозяйств и работы опытного завода. Вот тогда и наступит начало налоговых отчислений с результатов деятельности НПК "Биостат". А пока деятельность НПК "Биостат" является не прибыльной, а затратной. В связи с этим, прошу исключить НПК "Биостат" из списка ликвидируемых и открыть снова расчётный счёт НПК в банке.
Председатель НПК "Биостат" Н.Золотухин
Академия наук УзССР Узбекское научно-производственное объединение "Кибернетика,ул.Ф.Ходжаева 34
06.06.83 №30202/1609-20 Зам. начальника главного управления микробиологической промышленности при совете министров СССР тов. Шендеренко Е.Р.
Сообщаем, что техническое решение по усовершенствованию конструкции аппарата для выращивания микроорганизмов, разработанное институтом кибернетики с ВЦ УзНПО "Кибернетика" АН УзССР и Янгиюльским биохимическим заводом, в 1977 году было реализовано на лабораторном (10л.), опытно промышленном (1200л.) и полупромышленном (50000л.) вариантах. Испытания аппаратов указанных ёмкостей проводили на Янгиюльском биохимическом заводе с использованием промышленных сред и штаммов микроорганизмов. Результаты испытаний показали работоспособность аппаратов во всех вариантов. Для дальнейшего развития работ в данном направлении и совершенствовании биотехнологии необходимо:
- произвести техническую доработку аппарата с перфорированной системой воздухораспределения ёмкостью 50м3 и оснастить его необходимыми контрольно-измерительными приборами;
- разработать рабочий проект по реконструкции действующих промышленных аппаратов и реализовать его на одном из них;
- реализовать стабилизацию микробиосинтеза на аппарате 50 м3 по "Способу приготовления питательной среды для выращивания микроорганизмов", разработанному ИК с ВЦ УзНПО"Кибернетика" АН УзССР и проверенному на аппарате ёмкостью 1200 л. Для успешного выполнения данных работ просим вашего содействия в плане организации и материального обеспечения.
Генеральный директор УзНПО "Кибернетика" АН УзССР академик АН УзССР В.К.Кабулов
Академия наук УзССР ордена трудового красного знамени институт кибернетики с вычислительным центром. г.Ташкент, ГСП, Володарского,26, "Кибернетика", №2/2015 21 октября 1975г.
В СЕКРЕТАРИАТ ВСЕСОЮЗНОГО БИОХИМИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА
Институт кибернетики с ВЦ АН УзССР направляет реферат сообщения Н.В.Золотухина для включения его в программу Х(МБК) Международного Биохимического Конгресса.
Зам. директора по науке член-корреспондент АН УзССР А.Н.Филатов
СОВЕТ МОСКОВСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ "27" февраля 1975г. № 01/7 Москва, В-71, Ленинский проспект, 33
В Узбекское Отделение Всесоюзного Биохимического Общества при АН СССР
Золотухин Николай Васильевич состоял членом Московского отделения Всесоюзного биохимического общества с 1969 года. Взносы уплачены по 1974 год включительно.
Секретариат.
В секретариат всесоюзного
биохимического общества
при АН СССР от ст.н.с.
института кибернетики
с ВЦ АН УзССР канд.биол. наук
Н.В. Золотухина
Прошу включить меня в состав туристической группы для поездки на Х МБК. Обязуюсь оплатить полностью расходы по поездке и членский взнос за участие.
16.10.75г. Н.В. Золотухин
Х МЕЖДУНАРОДНЫЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС (МБК)
Глубокоуважаемый Николай Васильевич
Организационный комитет рассмотрел представленные вами тезисы на Х МБК. В связи с ограниченным количеством мест, согласно плану госкомитета по науке и технике, оргкомитет не имел возможности включить ваши тезисы в число работ, представляемых на конгресс.
Оргкомитет
СПРАВКА
Дана мною Золотухиным Николаем Васильевичем, автором реферата: "К вопросу о природе саморегулирования интенсивности биоэнергетических и биосинтетических процессов", в том, что я при написании указанной работы не использовал ни результатов незавершённых работ, ни данных, составляющих государственную тайну, ни других материалов, не подлежащих опубликованию в открытой печати. Рукопись посвящена связям между энергетическими и синтетическими процессами в функционирующей клетке. В рукописи не содержится сведений, не подлежащих опубликованию в открытой печати, согласно "Указаниям о порядке подготовки к опубликованию сведений о технических достижениях СССР, которые могут быть признаны изобретениями или открытиями", введёнными комитетом по делам изобретений и открытий при СМ СССР по координации научно-исследовательских работ и главлитом при СМ СССР 3 сентября 1962г. В рукописи отсутствуют ссылки на закрытие литературные источники и другие неопубликованные служебные материалы учреждений, организаций и ведомств. В указанной рукописи не содержится сведений о научных исследованиях в промышленности государств социалистического лагеря, неопубликованных в открытой печати СССР и в печати социалистических государств в связи с чем не требуется получения отдельных разрешений от соответствующих органов этих государств на опубликование сведений, приводимых в указанной работе. Я обязуюсь сообщить издательству об ограничительных грифах, если в процессе издания работы такие грифы на неё будут наложены.
Я, Золотухин Николай Васильевич предупреждён об ответственности за разглашение государственной тайны, согласно статье 75 УК РСФСР
20 октября 1970 г.
АКТ ЭКСПЕРТИЗЫ
материалов /экспонатов/, подготовленных к открытой публикации
Экспертная комиссия института кибернетики с ВЦ АН УзССР, созданная согласно приказу директора ИК с ВЦ АН УзССР №18 ст 3 февраля 1970г., в составе: председателя Абуталиева Ф.Б., д.ф, зав.лаб.
и членов: Алламиярова Б., эксперта, Якубова М.Х., к.т.н., зав.лаб., патентоведа, Тешабаевой А.С., ст. инспектора 1-го отдела ИК рассмотрела тезисы Золотухина Н.В. "К вопросы о природе саморегулирования интенсивности биоэнергетических и биосинтетических процессов в функционировании выполненную клетке". по открытому проблемно-тематическому плану ИК на 1975г.
Руководствуясь:
а) Перечнем сведений, составляющих государственную тайну, и других сведений подлежащих засекречиванию по АН СССР и АН союзных республик 1969г. издания;
б) "Перечнем сведений, запрещённых к опубликованию в открытой печати, передачах по радио и телевидению", изданным в 1970 году, а также документами, дополняющими перечень, а также распоряжением, изд. в 1972г.
в) "Указаниями о порядке подготовки к опубликации сведений о научно-технических достижениях СССР, которые могут быть признаны изобретениями или открытиями 1965 года издания, экспертная комиссия подтверждает, что: в понятие открытой публикации входит: опубликование в печати, демонстрация в кинофильмах, на выставках, ярмарках, передачах по радио и телевидению, доклады на съездах, конференциях, при защите диссертаций и т.д. вывоз за границу.
1. В рассмотренной работе не содержатся сведения, запрещённые и опубликованию документами, наименованными в пп "а","б","в".
2. а) не содержатся сведения, которые могли бы составить предмет изобретения или открытия.
б) не имеется сведений об изобретений , открытиях, защищённых авторскими свидетельствами, патентами, дипломами.
в) заявка в комитет по делам изобретений и открытий не материалы данной работы не подавалась
3. В рассмотренной работе не использованы лит. источники и документы с грифом секретности для служебного пользования", а также незаконченные научно/исследовательские работы
4. На публикацию работы не следует
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: На основании вышеизложенного комиссия считает, что рассмотренные материалы могут быть опубликованы в открытой печати.
Председатель комиссии : Абуталиев Ф.Б.
Члены комиссии: Алламияров Б.К., Якубов М.Х., Тешабаева А.С.
На правах рукописи Н.В. Золотухин
ИССЛЕДОВАНИЕ ХЕМОСИНТЕЗА У ВОДОРОДНЫХ БАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ УПРАВЛЯЕМОГО ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ.
Специальность 091 - биофизика
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Издательство московского университета 1970
ВВЕДЕНИЕ
Водородные бактерии /род Hydrogenomonas/ относятся к микроорганизмам, в основе жизнедеятельности которых лежат процессы окисления молекулярного водорода с использованием кислорода до воды и фиксации углекислоты за счёт энергии, высвобождаемой при данном окислении /Rapaske,1966/. Данные микроорганизмы являются факультативными автотрофами. В автотрофных условиях они используют три газа /Н2, О2, и СО2/ и ряд неорганических соединений. В гетеротрофных условиях водородные бактерии потребляют как источники углерода и энергии различные органические соединения. Исследования водородных бактерий в автотрофных условиях роста имеют большое значение с точки зрения познания различных сторон метаболизма клетки и управления этим процессом. Именно в этих условиях имеется наибольшая возможность изучения биоэнергетических, биосинтетических и других процессов, протекающих в интактной клетке, т.к. источники энергии /Н2/ и углерода /СО2/ не представляют собой единого вещества и поэтому могут контролироваться независимо друг от друга. Интерес к водородным бактериям в последнее время очень возрос в связи с их высокой биосинтетической активностью и возможностью практического использования. Первое обстоятельство важно для многих биологических исследований, которые можно проводить лишь при наличии больших количеств биомассы. Практическая ценность водородных бактерий заключается в реальности их использования в системах жизнеобеспечения замкнутых экологических пространств /Bongeis,kok, 1964; Воронин, Поливода, 1967/, для получения кормового и пищевого белков, а также и других биологически активных соединений /Waslien, Calloway, 1967; Calloway, Kumar, 1969/.
В связи с указанными потенциальными возможностями водородных бактерий, в последние годы проводятся широкие исследования различных сторон жизнедеятельности этих организмов. Газовое питание данных бактерий при этом является особым предметом исследований. Работы в этой области проводятся при помощи методов манометрии /Schuster, Schlegel, 1967/, газовой хроматографии /Ammann etab, 1968/, датчиков кислорода, углекислоты, но не водорода /Bongers, Medici,1968/. Первые два метода обладают тем недостатком, что они не дают возможности непрерывной регистрации и регуляции концентраций растворённых газов непосредственно в растущей бактериальной культуре. Регистрация же растворённого водорода, наряду с регистрацией О2 и СО2, открывает более широкое поле исследований метаболизма данных бактерий, т.к. водород для них является энергетическим субстратом. Кроме того, непрерывная регистрация и регуляция концентраций трёх указанных газов является необходимой основной для автоматизации процесса обеспечения растущих клеток этими компонентами в нужных количествах и соотношениях. Настоящая работа посвящена разработке методов непрерывной регистрации и определения водорода, кислорода и углекислоты непосредственно в растущей культуре водородных бактерий, изучению процессов использования этих газов растущими клетками и синтеза биомассы, в зависимости от состояния клеток и соотношения Н2:О2:СО2. В работе приводятся также методы расчёта эффективности использования свободной энергии водорода данными микроорганизмами и оценки степени сопряжённости биоэнергетических процессов с биосинтетическими. Кроме того, в работе дано описание установки для выращивания водородных бактерий в условиях управляемого газового питания.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Во всех экспериментах был использован штамм Hydrogenomonas eutropha Z-1 /Савельева, Жилина, 1968/. Для выращивания и изучения бактериальной культуры применяли среды следующего состава (г/л):
среда №1 - Na2HPO4 - 9,0; KH2PO4 - 1,5; NH4CL -1,0; NaHCO3 - 0,5; MgSO4 7H2o - 0,2; Fe(NH4)C6H5O7 - 0,012; CaCL2 - 0,02 и микроэлементы по Хогланду;
среда №2 - KH2PO4 - 0,5; K2CO3 - 0,4; NaHCO3 - 0,6; NH4CL - 0,8; остальные компоненты те же,, что в первом случае;
среда № 3 - NaHPO4 - 6,0; KH2PO4 - 0,6; остальные компоненты те же, что в среде №1.
Чистоту культуры проверяли путём высева на чашки с картофельным агаром проб, которые отбирали сразу после засева среды и в конце опытов. Измерения биомассы проводили по оптической плотности культуры или по весу сухих клеток. Белок определяли во Лоури. Посевным материалом служила культура H.eutropha Z-1, выращенная в атмосфере, состоящей из 75% Н2, 15% О2 и 10% СО2.
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Определение и регистрация водорода и кислорода. Известно, что водород и кислород активно взаимодействуют с платиной. Это взаимодействие представляют в виде следующих реакций:
Н2 = 2Н+ + 2е /1/
О2 + 4Н+ + 4е = 2Н2О /2/
О2 + 2Н+ + 2е = Н2О2 /3/
О2 + Н+ + е = НО2 /4/
Кроме того, предполагают, что кислород взаимодействует с платиной через посредство различных примесей и загрязнений, присутствующих в газе, растворе и на платине. Это взаимодействие представляется в виде реакций:
П + О2 = ОП + ne + nH+ /5/
где П - концентрация примесей, ОП - концентрация окисленных примесей, О2 - концентрация кислорода, n- стехиометрический коэффициент /Wroblowa etal, 1967/. В случае кислорода потенциал платины положительный, в случае водорода - отрицательный.
Приведённые выше свойства платины были нами использованы при разработке метода регистрации водорода и кислорода одним датчиком непосредственно в культуре водородных бактерий. Мы предложили, что одновременное присутствие водорода и кислорода в растворе должно создавать на платине потенциал, значения которого будут однозначно соответствовать соотношению водорода и кислорода. Предположения эти подтвердились в эксперименте /рис.1/.
Установление зависимости потенциала платинового электрода от соотношения Н2:О2 дало возможность применить его в качестве индикатора Н2 и О2 в растущей культуре водородных бактерий. Рост последних в автотрофных условиях характеризуется тем, что необходимо постоянно возобновлять потреблённые объёмы водорода, кислорода и углекислоты в определённом соотношении. Поэтому, имея индикатор соотношения Н2:О2 и регистрируя скорости потребления этих газов и роста биомассы, легко обеспечивать растущие бактерии данными газами в оптимальном или ином соотношении.
2. Определение расхода и кинетики потребления углекислоты растущей культурной водородных бактерий. Кинетику потребления углекислоты изучаемой культурой мы регистрировали по рН, а расход её определяли путём прямых измерений восполняемых объёмов углекислоты, использованных клетками за определённые промежутки времени.
В основу данного метода были положены работы, в которых регистрацию углекислоты проводили по рН среды /Spruit, kok, 1956/. Кроме того, нами специально была подобрана среда для культивирования водородных бактерий, кислотность которой полностью определялась содержанием в ней углекислоты. Точность метода зависит от буферной ёмкости и исходного значения рН среды. Чем меньше была первая и выше последняя величины, тем чувствительнее становился метод. Исходное значение рН в наших опытах равнялось 8-9 единицам. При этих условиях прибор регистрировал изменения концентрации углекислоты на 0,2% и менее. Учитывая то, что для роста водородных бактерий необходимо не менее 10% углекислоты в смеси водорода и кислорода, указанная чувствительность вполне приемлема не только для обеспечения клеток углекислотой в нужном количестве, но и для измерения расхода и регистрации кинетики потребления её в процессе хемосинтеза.
Рис. 1. Зависимость потенциала платинового электрода от соотношения Н2:О2 и концентрации клеток в среде/г/л/: 1-0,62; 2-1,25%; 3-2,50.
На рис. 2 показан пример регистрации рН в растущей культуре Н.eutropha в ответ на изменения содержания СО2 в реакторе. Водород и кислород при этом в реактор подавались непрерывно в оптимальном соотношении. Из этих данных следует, что периодические добавления углекислоты в реактор, где она поглощалась клетками, вызывали в периодические подкисления культуры. Постоянное поступления СО2 в реакторе вместе с водородом и кислородом в оптимальном соотношении поддерживало рН среды на одном уровне /рис.2, участок АВ/. Последующее исключение углекислоты
Рис. 2. Изменения рН /1/ и оптической плотности культуры Н.eutropha /2/ при различных режимах поступления СО2 в реактор. Объём жидкой фазы - 0,5л, газовой - 0,7 л. Среда №3.
из поступающей в реактор с бактериями газовой смеси вызывало немедленное подщелачивание культуры /рис. 2, участок ВС/, которое не имело место в отсутствие кислорода. Именно по скорости подщелачивания среды можно регистрировать кинетику потребления углекислоты данными бактериями.
3. Установка для изучения процессов хемосинтеза у водородных бактерий. Для изучения процессов использования водорода, кислорода, углекислоты и синтеза биомассы водородными бактериями была собрана установка, в основу работы которой были положены вышеописанные методы. Схема установки показана на рис.3. Установка представляет собой стеклянный сосуд /1/ ёмкостью по 2 л. установленный на магнитной мешалке /7/. В сосуд /реактор/ введены платиновый электрод /2/, рН-электрод /3/, электроды сравнения типа ХСР /4,5/, железный сердечник для перемешивания /6/, осуществляемое магнитной мешалкой /7/; ввод для газов /11/ и пробоотборник /12/. Показания электродов снимаются потенциометрами ЛПУ-0,1 /9/ и ЛПМ-60М /8/ и передаются на многоточечный самописец ЭПП-09 /10/. ВВод для газов соединён с тремя мерными цилиндрами /на схеме показан только один-13/, наполненными соответственно водородом, кислородом и углекислотой или их смесью. Газы из цилиндров в реактор подаются давлением столба жидкости в сосуде /14/, соединённом с цилиндрами резиновыми шлангами /система сообщающихся сосудов/.
Реактор полностью герметичен и поэтому обеспечивает чистоту культуры в процессе опыта. Кроме того, установка предусматривает ручную или автоматическую подачу газов в реактор и поддержание их содержания в нём в пределах от 0 до 100%.
На рис.4 показан пример одновременной регистрации соотношения Н2:О2 и рН в изучаемой культуре, когда водород и кислород поступали в смеси оптимального состава, а углекислота добавлялась периодически. Содержание последней в реакторе при этом колебалось в области 5-10%, т.е. этот компоненты присутствовал в среде постоянно. Параллельные измерения биомассы констатировали, что синтез её идёт непрерывно и коррелирует с расходом всех газов. Как видно из приведённых данных, значение величины Н2:О2 практически не менялось, а значение рН колебались в ответ на добавление СО2 в реактор и потребление её бактериями.
Рис. 4. Пример одновременной регистрации соотношения Н2:О2 /1/ и рН растущей культуры H.eutropha /2/, при постоянном поступлении в реактор смеси 80% Н2+20% О2 и периодическом добавлении углекислоты.
В случае избытка или недостатка кислорода в газовой смеси величина Н2:О2 соответственно либо уменьшалась, либо возрастала до значений, при которых рост бактерий не имеет места. Вместе с остановкой роста бактерий прекращалось и подщелачивание среды, т.е. процесс фиксации углекислоты бактериями при этом также останавливался.
4. Оценка эффективности хемосинтеза у водородных бактерий.
Водород используется данными микроорганизмами в биоэнергетических процессах, где происходит аккумуляция его свободной энергии и в биосинтетических реакциях, начиная с регенерации НАДН2, с которого он затем переносится на те или иные акцепторы. В обоих случаях, в конечном итоге, происходит окисление водорода, сопровождающееся уменьшением его свободной энергии. При окислении одного моля АТФ из АДФ и неорганического фосфора /Gundersen, 1968/. В результате этого окисления свободная энергия водорода уменьшается на 56 ккал /Repaske, 1966/. На образование же одного моля АТФ в аналогичных условиях затрачивается 9 ккал /Ленинджер, 1966/. Следовательно, к.п.д. /к1/ процесса образования АТФ в данном случае равен 0,48. Образование НАДН2 в системе Н2 - НАД сопровождается падением потенциала примерно на 0,1 в, что эквивалентно потери свободной энергии Н2 в количестве 4,5 ккал. Отсюда следует, что к.п.д. /к2/ образования НАДН2 равен 0,92. Исходя из этих данных, мы вывели формулу для оценки эффективности использования свободной энергии Н2 водородными бактериями на уровне образования НАДН2 и АТФ, которая имеет следующий вид:
Ех = (К1Е1 + К2Е2)/Е0 *100% /6/
где Ех- процент или часть использованной свободной энергии водорода бактериями на уровне образования АТФ и НАДН2;
Е1 и Е2 - количество свободной энергии Н2, затраченной в процессах образования АТФ и НАДН2 соответственно;
Е0 - общая свободная энергия водорода, использованного бактериями.
Так как у водородных бактерий имеется механизм свободного окисления водорода, то мы ввели также оценку степени сопряжённости биоэнергетических процессов с процессом фиксации углекислоты и общим биосинтезом. Первую величину мы рассчитывали по формуле:
Ес = Н2в/Н20*100% /7/
где Ес - степень сопряжённости биоэнергетических процессов с процессом фиксации углекислоты;
Н20 -общее количество Н2, использованного клетками при хемосинтезе; Н2в- разность между общим количеством водорода и количеством его, затрачено м бактериями на восстановление кислорода, т.е. на образование воды из Н2 и О2.
Степень сопряжённости биоэнергетических процессов с общим биосинтезом у водородных бактерий мы рассматривали как произведение Ех и Ес, выраженное в частях: Еф=ЕхЕс /8/
РОСТ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГАЗОВ КУЛЬТУРОЙ Н.EUTROPHA
1. Рост при различных соотношениях Н2:О2:СО2. Опыты проводили с культурой, находящейся в различных физиологических состояниях или с момента внесения посевного материала и до наступления стационарной фазы роста. Во всех случаях бактерии росли на среде №3, в которой концентрации основных биогенных компонентов, за исключением фосфатов, такие же, что и в среде, рекомендованной Шлегелем с соавторами и используемой другими авторами /Веденина, 1968; Савельева, 1969/. Было установлено, что рост бактерий прекращается как в отсутствии О2, так и СО2. Непрерывное увеличение концентрации СО2 от 0 до 15% в смеси водорода и кислорода также непрерывно повышало скорость синтеза биомассы бактериями. Максимальное значение этой величины наступало при 10-15% СО2. Наиболее высокую скорость /удельную/ роста бактерий м=0,22 час-1/ наблюдали в экспоненциальной фазе роста. Кратковременные изменения соотношений Н2:О2 от 2 до 30 и более и углекислоты от 0 до 30% не инактивировали культуру, скорость синтеза биомассы в таких условиях была в несколько раз ниже той, которую наблюдали в условиях оптимальных соотношений Н2:О2:СО2. Значения последних для активно растущей культуры равнялись примерно 7:2:1 соответственно.
Анализы белковых соединений в биомассе Н.eutropha показали, что количество их в клетках возрастало по мере перехода культуры в экспоненциальную фазу роста, достигало максимума /70%/ и затем непрерывно снижалось. В начале стационарной фазы роста бактерий содержание белка в биомассе было около 30%. Эти данные находятся в соответствии с теми, которые получила Веденина /1968/ для этого же штамма бактерий. Следует отметить, что начало роста данного вида наступает через 30-40 мин. после перенесения клеток на свежую среду, если парциальное давление кислорода в газовой атмосфере не превышает 5-6%. Указанное время почти в 50 раз меньше того, которое получено в случае неуправляемого газового питания данных микроорганизмов /Веденина, 1968/. Увеличение парциальных давлений кислорода выше указанных значений обычно отодвигало во времени начала роста бактерий.
2. Фиксация углекислоты. Исследование процесса использования углекислоты Н.eutropha проводили с момента внесения посевного материала в свежую среду и до наступления стационарной фазы роста культуры. Соотношение всех газов при этом поддерживали в области значений, которые не являются лимитирующими для данных бактерий /Н2 - 60-80%, О2 - 5-20% и СО2 - 10-15%/. Фиксация углекислоты бактериями начиналась через 30-40 минут после засева среды. Скорость процесса непрерывно возрастала по мере перехода культуры в экспоненциальную фазу роста, достигала максимума и затем непрерывно снижалась к нулевым значениям с наступлением стационарной фазы роста. Максимальное значение указанной величины (0,30 - 0,35 л/час/г) наблюдали через 10-15 часов роста бактерий. Эта же величина, рассчитанная по приросту биомассы, в данный момент времени равнялась 0,5-0,6 л/час/г. К началу стационарной фазы последняя составляла 0,15 , а первая - 0,01 л/час/г. Такое расхождение указанных скоростей, вероятно, обуславливалось истощением среды. Последнее, по-видимому, меняло число и направленность реакций, в которых углекислота служит исходным компонентом. На это указывают уменьшение концентрации белка и увеличение содержания поли -в- оксимасляной кислоты в биомассе при непрерывном её росте. /Веденина, 1968; Савельева, 1969/.
3. Использование водорода и кислорода. Общий поток водорода в клетки водородных бактерий мы разделили на два: а) поток водорода в биоэнергетические реакции, завершающиеся аккумуляцией энергии или её рассеиванием и образованием воды из Н2 и О2; б) поток водорода в биосинтетические процессы через реакцию образования НАДН2, который затем участвует в восстановлении углекислоты. Первую величину мы определяли как количество водорода, необходимое для восстановления кислорода в реакции образования воды, а вторую - как разность между общим расходом Н2 и количеством его, затраченном на восстановление кислорода. Обе величины имеют размерность - литр газа/час/г сухой биомассы. Было установлено, что одновременно с ростом биомассы и скорости использования углекислоты клетками возрастала и скорость потребления водорода. Кислород в начале роста культуры использовался в количестве, которое было в несколько раз меньше количеств потреблённых Н2 и СО2. Через 10-15 часов роста бактерий скорость использования Н2 клетками достигала максимума - 1 л/час/г - и затем непрерывно снижалась. В начале стационарной фазы эта величина составляла примерно 0,05 л/час/г. Аналогично менялись потоки водорода в биоэнергетические и биосинтетические процессы. Значения данных величин в указанные моменты роста бактерий составляли 0,5 и 0,6, 0,03 и 0,02 л/час/г соответственно. Максимальное значение потока водорода в биоэнергетические процессы и, следовательно, максимум использования кислорода клетками достигались несколькими часами позднее максимума потока водорода в биосинтетические реакции. Общая картина изменений биосинтетической активности и процессов использования газов клетками Н.eutropha в стационарной культуре изображена на рис.5. Исследование свободного /холостого/ окисления водорода, которое не сопряжено с аккумуляцией энергии и, следовательно, синтезом биомассы клетками, показало следующее. Данное окисление всегда имело место в отсутствии углекислоты или при высоких парциальных давлениях О2>25%. Скорость использования Н2 и О2 при этом оставалась постоянной во времени независимо от фазы роста бактерий и была в 2-4 раза меньше, чем при сопряжённом окислении. Соотношение потребляемых газов при этом равнялось 2:1:0 соответственно для Н2:О2:СО2.
Рис. 5. Изменения биомассы /1/, удельной скорости роста /2/ культуры Н.eutropha, содержания белка в её биомассе /3/ и процессов использования ею водорода /4/, кислорода /5/ и углекислоты /6/.
На рис. 6 показаны изменения оптической плотности биомассы растущей культуры Н.eutropha, и скорости потребления СО2 из смеси водорода и кислорода. Эти данные хорошо иллюстрируют полную зависимость синтеза биомассы водородными бактериями от углекислоты и влияние её на скорость окисления водорода клетками данных бактерий.
Рис.6. Изменения процесса синтеза биомассы /1/ и скорости окисления водорода растущими клетками Н.eutropha /2/ при периодическом исключении СО2 из смеси Н2 и О2.
4. Эффективность использования свободной энергии водорода.
Как известно, каждая фаза микроорганизмов представляет собой совокупность клеток, находящихся в определённом состоянии. Каждое такое состояние характеризуется определённой биосинтетической активностью и конкретным биохимическим составом клеток. Всё это определяется, в конечном итоге, не только концентрациями исходных для биосинтеза компонентов во внеклеточном пространстве, но и, вполне вероятно, концентрациями внутриклеточных компонентов и активностями ферментных систем клеток. Если это так, то каждое состояние живых микробных клеток должно характеризоваться и определённой эффективностью использования свободной энергии окисляемого субстрата. Для проверки этого положения мы провели расчёты эффективности использования свободной энергии водорода растущими клетками Н.eutropha и степеней сопряжённости биоэнергетических процессов с процессами восстановления углекислоты и общим биосинтезом. Результаты этих расчётов сведены в таблицу 1.
Данные таблицы показывают, что рост Н.eutropha начинается при довольно высокой эффективности использования свободной энергии Н2 клетками и высоких степенях сопряжённости биоэнергетических и биосинтетических процессов. Почти такая же картина получается при низких парциальных давлениях О2 /сост.8/ и высоких концентрациях СО2 /сост.7/. Наиболее высокая степень сопряжённости биоэнергетики с общим биосинтезом - Еф - была получена в условиях дефицита кислорода. С увеличением его концентрации до 25-30% в газовой фазе реактора приводило к разобщению процессов фиксации углекислоты принимала нулевое значение. Рост биомассы при этом не происходил. Аналогичный эффект вызывало и исключение СО2 из газовой смеси. Дальнейшее постепенное увеличение концентрации углекислоты принимала нулевое значение. Рост биомассы при этом не происходил. Аналогичный эффект вызывало и исключение СО2 из газовой смеси. Дальнейшее постепенное увеличение концентрации углекислоты в смеси Н2 и О2 вызывало непрерывное возрастание скорости синтеза биомассы и значений величин ЕХ, ЕС, и ЕФ до максимальных значений при тех или иных условиях роста культуры.
Таблица 1. Эффективность использования свободной энергии водорода и степени сопряжённости процессов фиксации углекислоты и биосинтеза с биоэнергетическими процессами у растущей популяции Н.eutropha
Состояния популяции : ЕХ,% : ЕС : ЕФ :
1. Начало роста х/ 82,81,80 77,79,78 0,63;0,64;0,62
2. Экспоненциальная фаза 67,64,65 42,35,39 0,28;0,22;0,25
3. Начало стационарной фазы 70,72,69 50,51,48 0,35;0,37;0,33
4. Рост при концентрации СО2=0% хх/ 48 0 0
5. Рост при концентрации СО2<5% 60,62,61 27,30,29 0,16;0,19;0,18
6. Рост при концентрации 5%<СО2<10% 74,70,66 54,51,50 0,40;0,35;0,33
7. Рост при концентрации СО2>10% 80,82,80 67,73,73 0,54;0,60;0,58
8. Рост при концентрации О2<10% 83,82,88 83,91,92 0,69;0,81;0,81
9. Рост при концентрации О2>25% ххх/ 48 0 0
х/ потребление газов в начале роста культуры шло в соотношении примерно равном 5,5:0,6:3,9; в экспоненциальной фазе - 7:2:1 в начале стационарной фазы - 7,2:1,8:1,0 соответственно для Н2,О2 и СО2,
хх/ изменение концентрации СО2 производили за счёт водорода при парциальном давлении О2 равном 15-20%,
ххх/ концентрацию О2 меняли за счёт водорода при парциальном давлении СО2 10-15%.
Кроме того, из приведённой таблицы следует, что одинаковые значения величины ЕХ /напр., сост. 1,7 и 8/ не говоря ещё о равенстве величин ЕС и ЕФ. Так, например, в указанных состояниях значениям ЕХ равным 82,83 и 73% и значения Еф - 0,63, 0,69 и 0,60. Иными словами, при одинаковых эффективностях использования свободной энергии водорода растущими бактериями вполне возможно неодинаковое распределение её между процессами биосинтеза и биоэнергетики. Аналогичная обработка литературных данных по использованию газов водородными бактериями и, в частности, исследуемым видом дала результаты, укладывающиеся в области значений, полученных нами. Например, при выращивании Н.eutropha в непрерывной культуре на синтез 1г сухой биомассы расходовалось примерно 6,5 л Н2 и 2л О2 /Amman et al, 1968/. Применяя наш метод расчёта, получаем для этих данных следующее: ЕХ=64%, ЕС=38% и Еф=0,30. Сравнивая эти результаты с данными приведённой выше таблицы, можно предположить, что бактерии в рассматриваемом случае находились в состоянии, соответствующем экспоненциальной фазе роста. В условиях стационарной культуры Н.eutropha с возрастом клеток соотношение потребляемых газов менялось от 5:2:1 до 6:2:1 соответственно для Н2:О2:СО2 /Zechtman et al, 1964/. Отсюда получаем, что ЕХ менялась от 59 до 62%, Ес - от 18 до 31% и Еф - от 0,10 до 0,19. Можно предположить, что в этом случае в начале роста культуры имели место либо недостаток СО2, либо избыток кислорода, которые со временем в некоторой степени устранялись. По данным Марино и Клифтона /Marino, Clifton,1955/ бактерии H.facilis потребляли Н2, О2 и СО2 в соотношении 6,4:1,9:1,0, а с увеличением возраста - 8,6:3,1:1,0 соответственно. Анализируя эти данные, получаем: Ех менялась от 65 до 60%, Ес - от 40 до 28% и Еф - от 0,26 до 0,17. Отсюда можно заключить, что данная культура росла в условиях уменьшения эффективности использования свободной энергии водорода и степеней сопряжённости процессов фиксации углекислоты и синтеза биомассы с биоэнергетическими процессами. В случае управляемого газового питания водородных бактерий, значения указанных величин легко корректировать путём изменения концентраций углекислоты или кислорода, которые, как было показано выше, значительно влияют на хемосинтез у этих микроорганизмов. Именно этим и объясняется введение понятий эффективности использования свободной энергии водорода, степеней сопряжённости биоэнергетических процессов с восстановлением углекислоты и общим биосинтезом у водородных бактерий. Полученные результаты анализа использования газов и синтеза биомассы данными бактериями показывают, что указанная оценка хемосинтеза может служить критерием состояния культуры водородных бактерий. Таким образом, изложенные результаты исследований на основе разработанных методов регистрации Н2, О2 и СО2 в растущей культуре водородных бактерий, дают основание считать, что уже имеется реальная возможность в той или иной мере управлять ростом этих микроорганизмов, влиять на распределение свободной энергии водорода между основными внутриклеточными процессами и, тем самым, менять или поддерживать на определённом уровне направленность бактериального метаболизма.
На рис.7 представлена схема участия газообразных и минеральных компонентов в метаболизме водородных бактерий.
Рис.7. Схема участия газообразных и минеральных компонентов в метаболизме водородных бактерий.
Из этой схемы следует, что водород участвует в двух процессах: а) в биоэнергетических, обеспечивающих энергий жизнедеятельность клетки и 2 б) в биосинтетических, обеспечивающих воспроизведение всех структурных и функциональных компонентов клетки. Включение водорода в эти процессы происходит с участием двух гидрогеназ. Мы предполагаем, что роль гидрогеназы Г1 сводится к активации Н2 в реакции восстановления НАД, служащего исходным компонентом в цепи переноса и преобразования энергии. Этот фермент, по-видимому, жёстко связан со структурами, в которых происходит превращение энергии электронов водорода в энергию связей АТФ и другие формы. Гидрогеназа Г2, вероятно, локализуется в цитоплазме и обеспечивает реакцию восстановления цитоплазматического НАД. Последний, в восстановленной форме, служит донатором водорода в биосинтезе. Кислород, как следует из схемы, выполняет роль конечного акцептора электронов в фосфоролируещей цепи и, в восстановленной форме, реагирует с протонами, превращаясь в воду. На схеме показана также, что углекислота служит исходным соединением, для реакций, идущих с участием минеральных компонентов - синтез белков, нуклеиновых кислот и т.п.: и для процессов, в которых минеральные компоненты не участвуют - синтез поли-в-оксимасляной кислоты, полисахаридов и т.п. Данная схема также показывает каким образом происходит окисление водорода в отсутствии СО2 и остановке биосинтеза. Мы предполагаем, что в случае остановки биосинтеза, например, из-за отсутствия углекислоты, окисление водорода идёт без образования АТФ или других переносчиков аналогичных по функциям соединений и завершается на уровне флавопротеина /Фп/ или цитохрома в . В случае высоких парциальных давлений О2 происходит, вероятно, ингибирование цитоплазматической гидрогеназы Г2. Блокировка этого фермента останавливает биосинтез, приводит к повышению концентрации АТФ до уровня, на котором возникает его ингибирующее действие на процесс окислительного фосфорилирования. Торможение последнего, по-видимому, создаёт условия для включения механизма свободного окисления водорода. Роль этого окисления, как мы предполагаем, сводится к регулированию биоэнергетических и биосинтетических процессов посредством приведения в соответствие концентраций метаболитов и скоростей реакций, обеспечивающих данные процессы. Кроме того, мы предполагаем, что в данном случае механизм свободного окисления выполняет также и защитную роль. Она сводится к тому, что при работе этого механизма усиливается теплопродукция, которая приводит к локальному повышению температуры в клетке. Последнее уменьшает растворимость О2 /т.к. с ростом температуры эта величина снижается/ и, следовательно, содержание его в клетке путём превращения его в воду, минуя процессы аккумуляции его свободной энергии. Уменьшение концентрации О2 в бактериальной клетке снимает его ингибирующее действие на гидрогеназу Г2.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны методы непрерывной регистрации и определения соотношения Н2:О2, а также содержания углекислоты в растущей культуре водородных бактерий. Методы основаны на применении стандартных рабочих электродов и электродов сравнения.
2. На основании разработанных методов сконструирована установка для изучения процессов синтеза биомассы и потребления водорода, кислорода и углекислоты растущей, интактной культурой водородных бактерий.
3. Установлено, что потоки водорода, кислорода и углекислоты в клетке растущей популяции Hydrogenomonas eutropha являются нестационарными. С начала роста популяции они возрастают, достигают максимума в период экспоненциального роста и затем снижаются к нулю по мере перехода культуры в стационарную фазу роста.
4. Показано, что поток водорода в реакции регенерации восстановителя в начале роста культуры Н.eutropha относительно преобладает над потоком его в биоэнергетические процессы; в экспоненциальной фазе роста это преобладание снижается и снова возрастает по мере затухания биосинтеза. Поток водорода в биоэнергетические процессы меняется обратно первому.
5. Установлено, что как скорость синтеза биомассы, так и скорости потребления водорода и кислорода интактной культурой прямо зависят от концентрации углекислоты.
6. Рассчитано, что эффективность использования свободной энергии водорода растущими клетками Н.eutropha на уровне образования НАДН2 и АТФ имеет наибольшее значение при низких концентрациях О2, в начальный и конечный моменты роста культуры.
7. Рассчитано, что степени сопряжённости биоэнергетических процессов с процессами фиксации СО2 и общим биосинтезом имеют максимальные значения в начальный момент роста Н.eutropha и низких концентрациях О2 (<10%). В отсутствии углекислоты и при высоких концентрациях О2 (>25%) указанные процессы разобщаются.
РАБОТЫ
опубликованные по теме диссертации
Золотухин Н.В. 1969. Рост водородных бактерий при имеющихся концентрациях водорода и кислорода. Изв. АН СССР, сер. биол., 3, 451.
Золотухин Н.В. 1969. Исследование хемосинтеза у водородных бактерий. Научн. докл. высш. школы, биол. науки, 7, 142.
Золотухин Н.В. 1969. Исследование хемосинтетической активности бактерий рода Hydronomonas. Доклад и тезисы доклада на 2 Всесоюзном биохимическом съезде. Ташкент.
Золотухин Н.В. 1970. Фиксация углекислоты развивающейся популяцией водородных бактерий. Изв. АН СССР, сер.биол.1,58.
Золотухин Н.В. Исследование водорода растущей популяцией бактерий рода Hydrogenomonas. В печати.
Золотухин Н.В. Влияние углекислоты на биоэнергетические и биосинтетические процессы у водородных бактерий. В печати.
Золотухин Н.В. Аккумуляция энергии растущей популяцией водородокисляющих бактерий. В печати.
ПОДП.К ПЕЧАТИ 21/УП-70 Г. Л-99983. Ф. 80Х90/18
ФИЗ.ПЛ. 1,75. ЗАК. 1531. ТИРАЖ 200 ЭКЗ.
ОТПЕЧАТАНО НА РОТАПРИНТАХ В ТИП.ИЗД.МГУ
МОСКВА, ЛЕНГОРЫ.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
АВТОРСКОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО
№ 753894
На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий выдал настоящее авторское свидетельство на изобретение: "Аппарат для выращивания микроорганизмов"
Автор (авторы): Золотухин Николай Васильевич, Якубов Эркин Магрупович, Ахметов Камил Ахметович, Щубин Александр Петрович, Зырянов Вадим Николаевич, Шакиров Гумар Каюмович и Скрипкин Станислав Сергеевич
Заявитель: ИНСТИТУТ КИБЕРНЕТИКИ С ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫМ ЦЕНТРОМ АН УЗБЕКСКОЙ ССР И ЯНГИЮЛЬСКИЙ БИОХИМИЧЕСКИЙ ЗАВОД ГЛАВНОГО УПРАВЛЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ПРИ СОВЕТЕ МИНИСТРОВ СССР
Заявка № 2526827 Приоритет изобретения 26 сентября 1977г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР
14 апреля 1980г. Действие авторского свидетельства распространяется на всю территорию Союза ССР.
Председатель Комитета
Начальник отдела
МПФ Гознака 1979. Зак. 79-3083
Союз ОПИСАНИЕ (11) 753894
Советских ИЗОБРЕТЕНИЯ
Социалистических К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву -
Государственный комитет (22) Заявлено 26.09.77 (21) 2526827/28-13 (51) М. Кл.3
СССР с присоединением заявки № - 12 в 1/10
по делам изобретений (23) Приоритет -
и открытий Опубликовано 07.08.80. Бюллетень №29 (53) УДК 663.14.
Дата опубликования описания 10.08.80 .033.2(088.8)
(72) Авторы изобретения Н.В.Золотухин, Э.М.Якубов, К.А.Ахметов, А.П.Щубин, В.Н.Зырянов, Г.К.Шакиров и С.С.Скрипкин
(71) Заявители Институт кибернетики с вычислительным центром АН Узбекской ССР и Янгиюльский биохимический завод
(54) АППАРАТ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
1
Изобретение относится к производству биомассы на основе выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих легкорастворимые органические и минеральные компоненты. 5
Известен аппарат для выращивания микроорганизмов, содержащий вертикальную цилиндрическую ёмкость с коническим днищем, укреплённые по высоте неподвижные перфорированные диски с расположенными на них трубками и клапанами для перелива жидкости, расположенными на них трубками и клапанами для перелива жидкости, расположенный в днище барботер воздуха и патрубки для подвода питательной среды и отвода биомассы (1). 10
Однако при работе такого аппарата в пространствах между перфорированными дисками образуется воздушно-жидкостная эмульсия, в результате чего снижается удельная производительность аппарата.15
Целью изобретения является повышения удельной производительности аппарата для выращивания микроорганизмов. 20
Достигается это тем, что предлагаемый аппарат снабжён камерой для предварительного смешивания питательной среды и воздуха, расположенной под его днищем, а на меньшем основании днища над камерой и большим основанием над барботером укреплены перфорированные перегородки, при этом перфорированные диски, размещённые в цилиндрической части аппарата, установлены с кольцевым зазором относительно стенки ёмкости, причём общая площадь перфорации диска составляет 35-45% от всей его площади, а величина зазора между дисками и стенками ёмкости составляет 0,02-0,1 от диаметра последней. 25
На фиг. 1 изображён описываемый аппарат для выращивания микроорганизмов, разрез; на фиг. 2 - перфорированный диск; на фиг. 3 - барботер воздуха, вид снизу.
Аппарат состоит из вертикальной закрытой цилиндрической ёмкости 1 с коническим днищем 2, расположенной под днищем камеры 3, снабжённой патрубками 4 и 5 для подвода среды и воздуха. На меньшем основании днища над камерой 3 и большем основании над барботером 6 укреплены перфорированные перегородки 7 и 8. При этом диски 9 установлены с кольцевым зазором относительно стенок ёмкости. Общая площадь перфорации перегородок и дисков составляет 35-45% от всей их площади, а величина зазора между дисками и стенкой ёмкости составляет 0,02-0,1 от диаметра цилиндрической части ёмкости. 5
Диски 9 укреплены на штоке 10 и упорах 11. Шток 10 укреплён при помощи резьбы в крышке 12 аппарата с возможностью перемещения по вертикали при помощи поворотного колеса 13. В верхней части аппарата имеется патрубок 14 для вывода биомассы, а в конической части - патрубок 15 для подвода воздуха в барботер 6. 10
Аппарат работает следующим образом. 15
Внутреннюю поверхность аппарата стерилизуют. Смесь компонентов питательной среды готовят в отдельных ёмкостях и перед подачей её в аппарат также стерилизуют. Для перемешивания среды используют воздух, подаваемый в аппарат компрессором. 20
После стерилизации аппарат наполняют питательной средой в таком количестве, чтобы её объём составляет 90-95% от объёма аппарата, который он имеет до патрубка 14. По патрубку 14 вводят чистую культуру микроорганизмов, подают в аппарат воздух, поддерживают определённую температуру в нём и другие параметры, определяемые выбранным режимом ферментации. 25
При этом воздух в аппарат подают следующим образом. Сначала его подают через патрубок 15 и барботер 6 в таком количестве, чтобы на поверхность среды по кольцу появились пузырьки воздуха. Затем открывают вход воздуха через патрубок 5. После этого регулируют скорость подачи воздуха через все его входы в аппарат так, чтобы газовые пузырьки на поверхности среды были бы распределены преимущественно равномерно, а уровень среды поднялся примерно на половину расстояния его от патрубка 14. После этого увеличивают нагрузку воздуха через патрубок 5 настолько, чтобы уровень среды в аппарате достиг отметки выхода её через патрубок 14. 30
Разница в нагрузках аэрирующего воздуха в центральной части аппарата и его периферийных частях обеспечивает циркуляцию жидкости в направлении от центра ёмкости к её стенкам по входящей линии, сохраняя при этом непрерывное её насыщение воздухом и, следовательно, непрерывное обеспечение микроорганизмов растворённым кислородом. 35
Таким образом, предлагаемый аппарат позволяет поддерживать плотность рабочей газо-жидкостной смеси в аппарате на уровне, превышающем таковой в 2-3 раза в аппаратах, в которых заложен принцип максимального эмульгирования питательной среды. А это в свою очередь создаёт основу для увеличения удельной производительности аппарата во столько раз, во сколько увеличивается коэффициент наполнения аппарата или плотность рабочей жидкости, т.е. в 2-3 раза. 40
По достижении концентраций микроорганизмов и компонентов питательной среды заданных пределов рабочий цикл повторяется либо процесс переводят на проточный режим. Для обеспечения непрерывного режима в аппарат через патрубок 4 начинают подавать питательную среду с требуемой скоростью. Среда, попадая в камеру 3, смешивается с воздухом, насыщается кислородом и в таком состоянии вместе с воздухом поднимается в верхние слои, проходя сквозь перфорированные перегородки и диски, при помощи которых она продолжает насыщаться кислородом. Последнее является необходимым условием для непрерывного роста микроорганизмов, использующих в своей жизнедеятельности кислород. 45
По мере продвижения среды в верхние слои она обедняется всеми питательными компонентами за счёт поглощения их микроорганизмами и в таком состоянии вместе с ними уходит из аппарата через патрубок 14. При этом скорость выхода среды с микроорганизмами равна скорости притока свежей среды в аппарат. Наличие же перфорированных элементов на пути движения среды и воздуха исключает возможность резкого вспенивания среды за счёт образования крупных газовых пузырей, а зазоры, имеющиеся между дисками и стенками аппарата, резко снижают возможность образования между ними воздушных подушек и пены. 50
В зависимости от режима ферментации расположение перфорированных дисков может меняться путём поднятия или опускания их за счёт поднятия или опускания штока 10 при помощи рукоятки. Такая необходимость возникает в том случае, если на поверхности среды начинает образовываться пена. При этом диски поднимают вверх до тех пор, пока верхний диск не появится на поверхности жидкости. В результате резко снижается пенообразование в верхних слоях микробной культуры. После этого положение дисков в процессе работы аппарата остаётся неизменным. 55
При отсутствии пененея среды верхний диск размещают на глубине, равной примерно расстоянию нижнего диска от перфорированной перегородки большего основания днища аппарата. На таком же расстоянии размещаются и другие диски относительно друг друга. 60
Таким образом, описываемый аппарат позволяет диспергировать воздух по всему его сечению и за счёт этого обеспечивать максимальное количество микроорганизмов кислородом, снижать пенообразование в аппарате и вследствие этого увеличивать плотность рабочей среды и повышать удельную производительность аппарата. 65
Формула изобретения
Аппарат для выращивания микроорганизмов, содержащей вертикальную цилиндрическую ёмкость с коническим днищем, укреплённые по высоте неподвижные перфорированные диски, расположенный в днище барботер воздуха и патрубки для подвода питательной среды и отвода биомассы, отличающийся тем, что, с целью повышения удельной производительности аппарата, под днищем расположена камера для предварительного смешивания среды с воздухом, а не меньшем основании днища над камерой и большем основании днища над камерой и большем основании над барботером укреплены перфорированные перегородки, при этом диски установлены с кольцевым зазором относительно стенки ёмкости, причём общая площадь перфорации диска составляет 35-45% от всей площади, а величина зазора между дисками и стенкой ёмкости составляет 0,002-0,1 от диаметра последней. 5
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 379611, кл. С 12 В 1/10, 1971 (прототип). 10
Редактор Л.Волкова Составитель Г.Лошкарёва Техред М.Петко Корректор О.Ковинская
Заказ 4846/22 Тираж 522 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
АВТОРСКОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО
№ 405944
На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий выдал настоящее авторское свидетельство Золотухину Николаю Васильевичу и другим, указанным в описании
на изобретение: "Способ определения концентрации микроорганизмов"
в соответствии с описанием изобретения и приведённой в нём формулой, по заявке № 1657697 с приоритетом от 4 мая 1971г.
Заявитель изобретения: Отдел микробиологии АН Молдавской ССР
Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Союза ССР 14 августа 1973г.
Действие авторского свидетельства распространяется на всю территорию Союза ССР.
Председатель Госкомитета
Начальник отдела
Московская печатная фабрика Гознака. 1974.Зак.13058.
Союз ОПИСАНИЕ 405944
Советских ИЗОБРЕТЕНИЯ
Социалистических К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Республик Зависимое от авт. свидетельства № -
Государственный комитет Заявлено 04.05.1971 (№ 1657697/28-13) М.Кл.С12к 1/10
СССР с присоединением заявки № - 12 в 1/10
по делам изобретений Приоритет -
и открытий Опубликовано 05.11.1973. Бюллетень №45 УДК 576.8 (088.8)
Дата опубликования описания 5.03.1974
Авторы изобретения Н.В.Золотухин, Л.А.Шакун, В.В.Котелев и И.И.Красиля
Заявитель Отдел микробиологии АН Молдавской ССР
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Изобретение относится к микробиологической промышленности. Известен способ определения концентрации микроорганизмов. 5
Предлагаемый способ позволяет более точно определять количество синтезируемой биомассы автотрофными организмами. 10
Для этого измеряют количество поглощённого углекислого газа и по калибровочной кривой судят о величине концентрации микроорганизмов. 15
Способ поясняется чертежом, на котором показана зависимость увеличения концентрации биомассы автотрофных микроорганизмов от расхода углекислоты. 20
Сущность изобретения заключается в следующем. 25
Для определения концентрации микроорганизмов используют автотрофные организмы, например водородные бактерии, для которых углекислый газ является единственным источником углеродного питания и полностью поглощается растущими клетками. Причём углерод углекислого газа идёт на синтез клеточных компонентов, т.е. биомассы. Поэтому расход углекислого газа в процессе выращивания автотрофных организмов служит показателем получаемой биомассы: чем больше будет израсходовано СО2 тем больше будет получаемой биомассы: чем больше будет израсходовано СО2, тем больше будет получено биомассы и наоборот. 30
Результаты определения биомассы водородных бактерий показаны в таблице.
Таблица
Из таблицы видно, что непрерывное увеличение концентрации биомассы приводит к непрерывному возрастанию оптической плотности культуры, расхода СО2 и содержания углерода в общей биомассе. Причём увеличение биомассы в начале опыта в 12,3 раза приводит к увеличению оптической плотности культуры в 10,6 раза, расход СО2 - в 12,7 раза и содержания углерода в биомассе - 12,4 раза. Из этих данных следует, что содержание углерода в синтезируемой биомассе водородных бактерий составляет в среднем 54%. 5
Таким образом, зная количество израсходованного СО2 и процентное содержание углерода в синтезируемой биомассе, определяют концентрацию биомассы автотрофных организмов и по калибровочной кривой судят о величине концентрации микроорганизмов. 10
Предмет изобретения
Способ определения концентрации микроорганизмов, отличающийся тем, что, с целью более точного определения количества синтезируемой биомассы автотрофными организмами, измеряют количество поглощённого углекислого газа и по калибровочной кривой судя о величине концентрации микроорганизмов. 15
Составитель М.Ларина
Редактор Л.Гончарова Техред А.Камышникова Корректор Е.Хмелёва
Заказ 222/12 Тираж 467 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытия Москва, Ж-35, Раушская наб. д. 4/5
Тип. Харьк. фил. пред. "Патент"
СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
АВТОРСКОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО
№ 966673
На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий выдал настоящее авторское свидетельство на изобретение: "Способ автоматического управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов в биореакторе и устройство для его осуществления"
Автор (авторы): Золотухин Николай Васильевич, Якубов Эркин Магрупович, Захидов Бахтияр Абдуллаевич, Юлдашев Абдурахман Вахабович, Исмаилов Абдулхайр Уттубекович
Заявитель: ИНСТИТУТ КИБЕРНЕТИКИ С ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫМ ЦЕНТРОМ АН УЗССР
Заявка № 3261391 Приоритет изобретения 12 марта 1981г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР
15 июня 1982г. Действие авторского свидетельства распространяется на всю территорию Союза ССР.
Председатель Комитета
Начальник отдела
МПФ Гознака 1979. Зак. 79-3083
Союз ОПИСАНИЕ (11) 966673
Советских ИЗОБРЕТЕНИЯ
Социалистических К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву -
Государственный комитет (22) Заявлено 12.03.81 (21) 3261391/28-13 (51) М. Кл.3
СССР с присоединением заявки № - G 05 D 27/00
по делам изобретений (23) Приоритет -
и открытий Опубликовано 15.10.82. Бюллетень №38 (53) УДК 663.14.
Дата опубликования описания 15.10.82 .032-63.132 (088.8)
(72) Авторы изобретения Н.В.Золотухин, Э.М.Якубов, Б.А.Захидов, А.В.Юлдашев и А.У.Исмаилов
(71) Заявители Институт кибернетики с вычислительным центром АН Узбекской ССР
(54) СПОСОБ АВТОМАТИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ ПРОЦЕССОМ НЕПРЕРЫВНОГО ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОРЕАКТОРЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Изобретение относится к автоматизации управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов, в частности при биосинтезе дрожжей и может быть использовано в других отраслях микробиологической промышленности. 5
Известен способ автоматического управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов в биореакторе, предусматривающий регулирование подачи питательного раствора в зависимости от его расхода с коррекцией по концентрации и рН биомассы (1). 10
Известно также устройство для осуществления данного способа, содержащее датчики расхода питательного раствора, концентрации и рН биомассы, регулятор стабилизации расхода питательного раствора с блоком задания, связанный с исполнительным механизмом, установленным на линии подачи питательного раствора, и через блок коррекции с датчиком рН среды с биомассой (1). 15
Недостатком этого способа и устройства является отсутствие связей между параметрами микробиосинтеза в биореакторе и выходными параметрами продукта, поскольку одной из важных связей является связь между концентрацией биомассы. Кроме того, на поглощение кислорода микроорганизмами большое влияние оказывает давление в биореакторе и поэтому не учёт связей между вышеуказанными параметрами уменьшает выход биомассы с единицы субстрата. 20
Цель изобретения - повышение выхода биомассы. Указанная цель достигается тем, что согласно способу автоматического управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов в биореакторе, предусматривающем регулирование подачи питательного раствора в зависимости от его расхода с коррекцией по концентрации биомассы и рН среды с биомассой, регулируют подачу кислорода на аэрацию по соотношению концентраций биомассы и растворенного кислорода с коррекцией по давлению в биореакторе. 25
Устройство для автоматического управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов в биореакторе, содержащее датчики расхода питательного раствора и через блок коррекции с датчиком рН среды с биомассой, снабжено датчиками растворённого кислорода и давления воздуха, установленными в биореакторе, и регулятором соотношение концентрации биомассы и растворённого кислорода, выход которого подключен к исполнительному механизму, установленному на линии подачи воздуха в биореакторе, а вход - с датчиками концентрации растворённого кислорода и биомассы непосредственно и с датчиком давления через блок коррекции. 5
На чертеже изображена принципиальная схема устройства, реализующего предлагаемый способ. 10
Устройство включает в себя биореактор 1, датчик 2 расхода питательного раствора, датчик 3 давления воздуха в биореакторе, датчик 4 концентрации растворённого кислорода в биореакторе, датчик 6 среды с биомассой, автоматический регулятор 8 стабилизации расхода питательного раствора, корректирующие блоки 9, 10 и 11 соответственно от датчиков 5, 6 и 3. 15
Расход питательного раствора измеряется датчиком 2, выход которого соединён с входом регулятора 8 расхода, выход последнего связан с исполнительным механизмом изменения расхода питательного раствора. Вход блока задания регулятора 8 расхода связан через корректирующие блоки концентрации биомассы и рН среды с биомассой соответственно. Вход автоматического регулятора 7 соотношения (концентрации биомассы - концентрация кислорода среды) связан с датчиками 5 и 4 концентрации биомассы и кислорода среды. 20
Выход регулятора 7 связан с исполнительным механизмом изменения расхода кислорода. Блок задания регулятора 7 через корректирующий блок 11 подключен к датчику давления воздуха в биореакторе. 25
Устройство работает следующим образом. Расход питательного раствора регулируется регулятором 8, на вход которого поступает сигнал от датчика 2 и корректирующие сигналы на задание от датчика 2 и корректирующие сигналы на задание от датчика 5 концентрации биомассы и датчика 6 рН среды с биомассой. 30
Соотношение концентрации биомассы - концентрация растворённого кислорода регулируется регулятором 7 путём воздействия на клапан расхода кислорода. Задание регулятора 7 корректируется по величине сигнала от датчика 3 давления в биореакторе. 35
Увеличение или уменьшение концентрации биомассы автоматически приводит к увеличению или уменьшению подачи кислорода в биореактор. 40
Увеличение или уменьшение концентрации биомассы автоматически приводит к увеличению или уменьшению подачи кислорода в биореактор. Причём оптимальная величина соотношения между концентрацией биомассы и концентрацией биомассы и концентрацией растворённого кислорода корректируется по величине давления воздуха в биореакторе. 45
Кроме того, в процессе выращивания микроорганизмов автоматически поддерживается расход питательного раствора с коррекцией по величине суммарного сигнала от изменения концентрации биомассы и рН среды с биомассой. Поддержание процесса поглощения кислорода в биореакторе в оптимальном режиме позволяет при прочих равных условиях повысить выход биомассы. 50
Данный способ был опробован при выращивании кормовых дрожжей на гидролизатах растительного сырья. Установлено, что в условиях управляемости процесса по соотношению концентрация кислорода в биореакторе - концентрация биомассы выход дрожжей с единицы редуцирующих веществ (РВ) значительно выше, чем по способам, по которым не определяют отношение концентрации кислорода к концентрации микроорганизмов и не корректируют эту величину в ходе процесса по давлению в биореакторе. 55
В случае выращивания кормовых дрожжей на гидролизных средах наибольший выход биомассы с единицы основного сырья (РВ) по предлагаемому способу получается при значениях отношений концентрации биомассы к концентрации растворённого кислорода в диапазонах равных 300-600 г/г. 60
Реализация устройства по предлагаемому способу позволяет увеличить выход дрожжей с одного и того же количества субстрата более чем 1,5 раза и соответственно снизить себестоимость продукта без дополнительных затрат. 65
Формула изобретения
1. Способ автоматического управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов в биореакторе, предусматривающий регулирование подачи питательного раствора, в зависимости от его расхода с коррекцией по концентрации биомассы и рН среды с биомассой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, регулируют подачу кислорода на аэрацию по соотношению концентраций биомассы и растворённого кислорода с коррекцией по давлению в биореакторе. 5
2. Устройство для автоматического управления процессом непрерывного выращивания микроорганизмов в биореакторе, содержащее датчики расхода питательного раствора, концентрации и рН биомассы, регулятор стабилизации расхода питательного раствора с блоком задания, связанный с исполнительным механизмом, установленным на линии подачи питательного раствора, и через блок коррекции с датчиком рН среды с биомассой, отличающееся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, оно снабжено датчиками растворённого кислорода и давления воздуха, установленными в биореакторе, и регулятором соотношения концентраций биомассы и растворённого кислорода, выход которого подключён к исполнительному механизму, установленному на линии подачи воздуха в биореакторе, а вход - с датчиками концентрации растворённого кислорода и биомассы непосредственно и с датчиками давления через блок коррекции.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 619511, кл. С 12 Q 3/00, 1977.
Составитель Г.Богачева
Редактор Н.Киштулинец Техред Е.Харитончик Корректор С.Шекмар
Заказ 7843/65 Тираж 914 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
АВТОРСКОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО
№ 913730
На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий выдал настоящее авторское свидетельство на изобретение: "Способ приготовления питательной среды для культивирования микроорганизмов"
Автор (авторы): Золотухин Николай Васильевич, Якубов Эркин Магрупович и Юлдашев Абдурахман Вахабович
Заявитель: ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КИБЕРНЕТИКИ С ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫМ ЦЕНТРОМ АН УЗССР
Заявка № 2916910 Приоритет изобретения 12 марта 1980 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР
16 ноября 1981 г. Действие авторского свидетельства распространяется на всю территорию Союза ССР.
Председатель Комитета
Начальник отдела
ВОДОРОДНЫЕ БАКТЕРИИ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
На получение 1 т сухой биомассы водородных бактерий затрачивается: СО2 - 1,8т /900м3/, О2 - 2,9т /2000м3/, Н2 - 0,63 т /7000м3/ и NH3 - 0,17т /224 м3/ и незначительные количества других минеральных компонентов. При этом получается около 0,7т белка, 0,05т углеводов и 0,25т других соединений. По предварительным данным биомасса водородных бактерий не требует специальной обработки, а белок её по аминокислотному составу и пищевым качествам близок к казеину, т.е. к белку молочному.
Основной проблемой в культивировании водородных бактерий является обеспечение клеток нужным количеством и определённым составом газовой смеси. На данном этапе эта проблема в основном решена при помощи методов непрерывной регистрации и определения величины Н2:О2 и концентрации СО2 непосредственно в культуральной жидкости.
Другой, не менее важной проблемой, является решение задачи управления минеральным питанием водородных бактерий. В решении этой проблемы наметился определённый прогресс.
Третьей, тоже очень важной, проблемой является устранение взрывоопасности процесса.
Над всеми этими проблемами и работает Группа. К настоящему времени выполнены следующие работы:
1. Усовершенствован метод непрерывной, одновременной регистрации величины Н2:О2 непосредственно в бактериальной культуре при помощи платинового электрода и электрода сравнения.
2. Разработан метод непрерывной регистрации концентрации СО2 в бактериальной культуре при помощи рН - электрода и электрода сравнения.
3. Разработан метод непрерывной регистрации источника азота в культуре водородных бактерий.
4. Выявлены условия снижения взрывоопасности процесса.
5. Разработана принципиальная технологическая схема получения биомассы водородных бактерий в условиях стерильности процесса.
Кроме того, имеется ряд незавершённых разработок или находящихся в стадии завершения. Разработки касаются управления микробиологическим синтезом и отдельными его реакциями.
Полученные результаты дают основание провести процесс в большом объёме, например, 1000л в условиях управляемости по газам. При этом наибольшей трудностью является создание в кратчайший срок системы автоматического обеспечения бактерий газами с расходом их около 20 м3 в час. Сам реактор - ферментер специально изготавливать, вероятно, не стоит, а приспособить для этих целей уже готовый.
В плане на нынешний год Группе предстоит оптимизировать среду по макроэлементам и выявить условия повышения растворимости водорода с целью интенсификации процесса.
В перспективе - изучение внутриклеточных механизмов, контролирующих прохождение основных биоэнергетических и биосинтетических процессов, в результате которых синтезируются конкретные биологически активные соединения. Кроме того, будет разрабатываться лабораторная установка параллельного выращивания гетеротрофных микроорганизмов с водородными бактериями.
/Н.Золотухин/ 17.02. 72г.
СПОСОБ УПРАВЛЕНИЯ РОСТОМ МИКРООРГАНИЗМОВ
ЗОЛОТУХИН Н.В.
ЯКУБОВ Э.М.
М.кл. С12
Изобретение относится к области получения продуктов микробиосинтеза (кормовых и пищевых дрожжей, бактерий, грибов и др., а также продуктов их метаболизма) на основе выращивания микроорганизмов.
Известные способы выращивания микроорганизмов предусматривают управление процессом на основе регулирования физико-химических параметров питательной среды (авт.св. №522228, кл. С12, "Бол. откр. и изобр..."№27, 1976г; авт. св. №502015, кл. С12, "Бюл. откр. и изобр...", №5, 1976 г).
Недостатком указанных способов является то, что они не учитывают прямых зависимостей скорости роста микроорганизмов от наличных концентраций компонентов их питания в среде. Поэтому при выращивании микроорганизмов по данным способам скорость их роста колеблется и эти колебания отражаются на производительности ферментеров.
Известен также способ, по которому, процесс выращивания микроорганизмов оптимизируют путём измерения и коррекции скоростей расхода аммония и источника углерода. Причём, скорость подачи последнего в аппарат регулируют пропорционально скорости расход аммония. При этом рН культуральной жидкости поддерживают постоянным путём коррекции его значений за счёт ввода в среду сильной щёлочи. Недостатком данного способа является то, что по нему не учитывается связь между скоростями поглощения клетками источников углерода и азота и наличными концентрациями других компонентов питательной среды, т.к. отсутствие или недостаток того или иного компонента (напр. фосфора, магния, калия и др.) питания клеток в среде также значительно влияют на скорость роста клеток. А при замедлении или остановке роста микроорганизмов из-за недостатка их питания вывод процесса в оптимальный режим за счёт коррекции расхода аммония и источника углерода практически невозможен.
Целью настоящего изобретения является разработка способа управления ростом микроорганизмов, по которому скорость их роста не ограничивалась бы наличными концентрациями питательных компонентов.
Поставленная цель достигается путём приведения в прямое соответствие всех концентраций компонентов питания клеток текущей концентрации микроорганизмов в этой же среде, а скорость их подачи в аппарат корректируют пропорционально скорости роста клеток.
Сущность изобретения заключается в следующем. Экспериментальным путём определяют абсолютные значения концентраций каждого компонента питательной среды в области максимальной скорости роста микроорганизмов (напр., в фазе логарифмического роста клеток). Одновременно с этим определяют и абсолютные значения концентраций биомассы в той же области. После этого делят значения концентраций биомассы в той же области. После этого делят значения концентраций каждого компонента питания на значения концентраций биомассы в этой же области. Этим самым устанавливают область значений удельных концентраций компонентов питательной среды, обеспечивающих максимальную скорость роста микроорганизмов. Определение данных величин проводят в периодической культуре микроорганизмов при росте их на известных средах. Его осуществляют путём отбора проб, например, через 15-60 мин в течении всего периода роста микроорганизмов. В отобранной пробе определяют концентрацию биомассы (например, по сухому веществу), концентрацию основного субстрата и концентрации остальных компонентов питания (источника азота, фосфора, железа и т.д.).
На рисунке в общем виде показана типичная картина изменения концентрации микроорганизмов и компонентов питательной среды в периодической культуре. Из этих данных следует, что рост любых микроорганизмов в периодической культуре во времени имеет различные скорости. Наибольшее значение данной величины наблюдается в, так называемой, логарифмической фазе роста (между точками). Именно в данной области (по предлагаемому способу) и определяют значения удельных концентраций компонентов питательной среды. Данные, полученные в этих опытах, затем используют в управлении ростом микроорганизмов при выращивании их не только в периодической, но и в непрерывной культуре микроорганизмов. Управление осуществляют следующим образом.
Установив в периодической культуре области значений удельных концентраций для каждого компонента питания микроорганизмов, в следующем опыте доводят концентрацию биомассы до заданных значений. При этом контролируют изменения концентрации биомассы (её увеличения) и концентраций компонентов питательной среды (их уменьшение). Значения последних делят на значения первых. Если при этом значения удельных концентраций для того или иного компанета.
К ВОПРОСУ О ПРИРОДЕ САМОРЕГУЛИРОВАНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ И БИОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ФУНКЦИОНИРУЮЩЕЙ КЛЕТКЕ.
Н.В.ЗОЛОТУХИН
Исследования саморегуляции различных реакций и процессов в интактной, функционирующей клетке имеют первостепенное значение для понимания различных сторон организации живых объектов. При этом особенно ценными, очевидно, являются результаты, полученные методами, которые не взаимодействуют с объектом исследования, но которые дают непрерывную информацию о течении основных процессов жизнедеятельности в различных ситуациях.
Получение непрерывной информации о ходе основных процессов, обеспечивающих метаболизм клетки, стало возможным в связи с тем, что для этих целей был найден весьма удачный объект - одноклеточные организмы, использующие для своей жизнедеятельности самые элементарные природные вещества (Н2, СО2, О2, NH3 и др.). Для данного объекта удалось разработать методы непрерывного получения информации о поглощении клетками субстратов для процессов биоэнергетики и биосинтеза. Данные методы при этом являются индиферентными по отношению к самой клетке.
Экспериментально нами установлено, что связи между энергетическими и синтетическими процессами в функционирующей клетке нежёсткие и могут легко разрываться. Это происходит при соответствующих мягких воздействиях как на биосинтез, так и на биоэнергетику клетки. Например, повышение концентрации конечного акцентора электронов в дыхательной цепи (О2) до "критического" уровня полностью останавливает биосинтез. При этом скорость использования энергетического субстрата и кислорода значительно снижается, но нулевых значений не принимает.
Уменьшение же концентрации источников углерода или азота в среде ниже "оптимальных" значений резко снижает скорости биосинтеза клеточных компонентов. Скорость биоэнергетических процессов также снижается, но в меньшей степени. Как в первом, так и во втором случаях процессы являются обратимыми.
Предполагается, что в первом примере включается механизм, отвлекающий свободную энергию субстрата от системы, аккумулирующей её в унифицированные биологические формы. Во втором же примере в качестве автоматического регулятора связей между биоэнергетической и биосинтетической системами, вероятно, служит дыхательный контроль.
Обсуждаются также и возможные альтернативы с учётом физико-химических свойств субстратов и внутренней среды.
19.10.75г. Н.Золотухин
НЕЗАВИСИМОСТЬ ПОТЕНЦИАЛОВ ПЛАТИНОВОГО И СТЕКЛЯННОГО ЭЛЕКТРОДОВ В ПРИСУТСТВИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВОДОРОДА И КИСЛОРОДА
Н.В.Золотухин
В экспериментах с водородоокисляющими бактериями мы обнаружили, на наш взгляд, очень интересные закономерности в поведениях потенциалов платинового игольчатого электрода и стеклянного электрода типа НСТ, ЭСЛ и др.
Данные микроорганизмы используют в своей жизнедеятельности Н2, СО2 и О2, а также ряд простых минеральных солей /1/. При выращивании водородокисляющих бактерий одной из методических трудностей является регистрация указанных газов непосредственно в среде, где происходит рост бактерий. Решая эту задачу, мы разработали довольно простые методы регистрации и определения Н2 и О2 /1/ и СО2 /2/, при помощи стандартных рабочих электродов и хлорсеребряного или каломельного электродов сравнения.
Было установлено, что потенциал платинового электрода в присутствии Н2 и О2 в среде однозначно соответствует значению величины Н2:О2. Изменение данного соотношения, например, от 2 до 10 /область оптимальных значений данной величины для роста бактерий/ сопровождается падением потенциала примерно на 150 мв и сохранением постоянства рН среды. Изменение потенциала при этом имеет линейный характер.
Растворённую углекислоту мы регистрировали и определяли по рН среды, которая без СО2 имела рН, равный 7,5-8,5 единиц.
Многочисленные опыты показали, что изменения потенциала платинового электрода и рН среды при температуре опытов 25-300С происходит независимо друг от друга, если давление в сосуде остаётся одинаковым во время измерений, а скорость перемешивания среды - постоянна. Парциальные давления газов при этом составляли: Н2 - 60-90%, О2 - 0-30%, СО2 - 0-30%. Значения обеих величин в данных условиях полностью определялись содержанием водорода, углекислоты и кислорода в среде. Так, например, на фоне медленного подщелачивания среды за счёт поглощения углекислоты бактериями величину потенциала платинового электрода можно резко менять в ту или иную сторону за счёт изменения соотношения Н2:О2 в герметичном сосуде, в котором выращиваются данные микроорганизмы. Эти изменения можно производить за счёт раздельных добавок Н2 и О2 или СО2 в сосуд. Так, например, в течение нескольких минут потенциал платинового электрода за счёт добавления в сосуд кислорода изменился от -140 мв до +70 мв, а показания рН-электрода оставались постоянными. Хотя, по известным зависимостям, рН среды при этом должен был измениться, по крайней мере, на 3 единицы. Эта независимость показаний стеклянного электрода сохранялась при изменении потенциала платинового электрода в положительную (при добавлении О2) или отрицательную сторону (при добавлении Н2). То есть в данном случае платиновый электрод становится обратимым как по кислороду, так и по водороду, т.к. его показания одновременно коррелируют с концентрациями водорода и кислорода, но не с концентрациями ионов водорода.
При постоянстве величины Н2:О2 в некоторых случаях вместе с рН менялся и потенциал платинновго электрода. Например, в процессе поглощения всех 3-х газов бактериями величина Н2:О2 может сохраняться постоянной, а в сосуде при этом будет создаваться разрежение. Выравнивание давления в сосуде путём добавления в него СО2 в ряде опытов сопровождалось снижением рН на 2 единицы и повышением потенциала на 40 мв, хотя по теории потенциал при этом должен измениться примерно на 118 мв.
В случае постоянства давления в реакторе смещений потенциала платинового электрода при изменении рН среды не наблюдали. Показали обоих электродов при этом менялись независимо друг от друга и обуславливались только парциальным давлениями водорода и кислорода /показания платинового электрода/ и углекислоты/ показания стеклянного электрода/.
Таким образом, в присутствии водорода и кислорода в растворе не наблюдается соответствия между потенциалом стеклянного электрода и изменениями э.д.с. платинового электрода, согласно которому изменение рН на единицу должно сопровождаться сдвигом потенциала в.э. на 59 мв.
Можно предположить, что водород и кислород, адсорбируясь на платине одновременно, переходят в какую то активную форму, в которой и взаимодействует друг с другом. В результате этого взаимодействия на платине возникает потенциал, пропорциональный концентрациям Н2 и О2, но не концентрации протонов в среде. Химическое сродство последних к платине значительно ниже той, которую имеют активные формы водорода и кислорода на платине. Поэтому изменение их концентрации в среде отражается только на потенциале стеклянного электрода, который в высокой степени обратим по протонам и который, вероятно, в данном случае инертен по отношению к Н2 и О2.
Линейная же зависимость потенциала платинового электрода от соотношения водорода и кислорода в растворе, по-видимому, может в некоторой степени служить доказательством того, что при относительно низких парциальных давлениях О2 /5-40%/ в смеси с Н2 его электрохимическая активность одинакова с активностью водорода, т.е. платиновый электрод в данном случае является обратимым как по водороду, так и по кислороду.
Литература:
1. Золотухин Н.В. 1969. Изв. АН СССР, сер. биол., 3.
2. Золотухин Н.В. 1970. Изв. АН СССР, сер. биол., 1.
КИСЛОРОДНО-ВОДОРОДНЫЙ ЭФФЕКТ НА ПЛАТИНЕ
Н.В.ЗОЛОТУХИН
Исследования электрохимических процессов, имеющих место на поверхности платины, имеют определённое практическое и теоретическое значение. Особый интерес при этом представляют работы по изучению электрохимических реакций, проходящих на платине, и присутствии молекулярного кислорода. Исследования подобного рода имеют довольно длинную историю и всё ещё далеки от завершения.
Для всех работ по изучению реакции кислорода на платине характерно то, что все они проводятся в условиях минимальных количеств компонентов в растворе, которые в той или иной степени могут взаимодействовать с платиной. То есть каждый исследователь в своей работе стремиться иметь дело с системой, как можно более чистой. Такой же подход и в работах по изучению электрохимических процессов на платине в присутствии водорода. В данном случае основной помехой является кислород, который значительно искажает результаты, получаемые в системах, в которых этот газ отсутствует.
В настоящее время является общепризнанным, что потенциал платинового электрода в присутствии водорода обуславливается реакцией: Н2 = 2Н+ + 2е /1/
Данная реакция обратима. Кроме того, считается, что её равновесное состояние определяется, в частности, концентрацией ионов водорода в растворе. Данный вывод сделан в соответствии с формулой Нернста, выведенной для термодинамического потенциала системы и представляется в виде следующей формулы: Е=Е0 + 2,303RT/nF*lg([H+]/P1/2n2) /2/
Из формулы /2/ следует, что потенциал водородного электрода определяется не только парциальным давлением водорода, но и концентрацией его ионов в растворе. Если Рн=1атм и Е0=0, то выражение /2/ будет описывать прямую зависимость потенциала электрода от рН: Е= 2,303RT/F*lg[H+] /3/
Из равенства /3/ следует, что потенциал водородного электрода прямо пропорционален рН и представляет линейную функцию от последнего. Например, при изменении рН раствора на единицу потенциал электрода должен сместиться на 59 мв. Эта закономерность хорошо воспроизводится во всех случаях, если в растворе отсутствуют компоненты, отравляющие платину или взаимодействуют с ней. Таковыми, например, являются цианид, сероводород, кислород и др. Какие процессы при этом возникают на платине, в настоящее время на этот счёт нет убедительных данных, кроме фактов необратимости процессов взаимодействия указанных соединений с платиной.
Свойство платинового электрода реагировать на изменения рН раствора было впервые установлено Бётгером в 1897 году /1/. Несмотря на широкое распространение стеклянного электрода в практике измерений рН, платиновый электрод, по мнению ряда исследователей /2/, не потерял своего значения для рН-метрии. Тем не менее, в последние годы был найден случай, когда платиновый /или водородный, как принято его называть в литературе/ электрод абсолютно не реагирует на изменения рН раствора. Подробно об этом будет сказано ниже.
В настоящее время особый теоретический и практический интерес представляет решение проблемы получения обратимого кислородного электрода. До сих пор не найден случай обратимости кислородного электрода, хотя высказано ряд предположений и выдвинуто несколько механизмов реакций, объясняющих процесс взаимодействия кислорода с платиной и причины необратимости этого процесса. Таковыми, например, являются гипотетические реакции:
О2 + 4Н+ + 4е = Н2О /4/
О2 + 2Н+ + 2е = Н2О2 /5/
О2 + Н+ + е = НО2 /6/
Но ни одна реакция не согласуется с поведением потенциала платинового электрода в присутствии кислорода в растворе.
Ряд авторов /3/ выдвинули гипотезу, которая объясняет явление необратимости кислородного электрода следующим образом. Предполагается, что кислород взаимодействует с платиной через посредство различных примесей и загрязнений, присутствующих в растворе и на платине. Это взаимодействие представляется в виде реакций окисления данных примесей кислородом:
П + О2 = ОП + ne + nH+ /7/
где П-концентрация примесей, ОП - концентрация окисленных примесей, О2 - парциальное давление кислорода, n-стехиометрический коэффициент. По данной гипотезе эта реакция необратима и именно она обуславливает необратимость кислородного электрода.
Других, более убедительных, объяснений необратимости кислородного электрода в настоящее время не известно. Отсутствуют также данные о поведении потенциала платинового электрода в присутствии кислорода в абсолютно чистых системах, которые, вероятно, пока ещё трудно реализовать практически.
В связи с вышеизложенным, представляет определённый интерес экспериментальный материал, полученный нами за последние 5 лет.
МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Толчком к исследованиям явления необратимости кислородного электрода для нас явилась проблема, на первый взгляд далеко отстоящая от данного вопроса. Проблема эта - получение пищевого белка и других биологически активных соединений из воды /или Н2 и О2/, углекислоты и ряда минеральных компонентов при помощи водородокисляющих бактерий. Синтез указанных веществ данными бактериями производится в объёме, представляющем собой сложный электролит /ионы аммония, калия, натрия, хлора и железа: фосфаты, сульфаты и микроэлементы/ и смесь Н2+О2+СО2, распределённая между жидкой и газовой фазами объёма.
Ведение данного микробиологического синтеза сопряжено с большими методическими трудностями, представляющими собой, в частности, непрерывную регистрацию и корреляцию концентраций Н2, О2 и СО2 в среде, в которой происходит синтез. Решение данной проблемы при помощи известных методов газового анализа не приносит желаемых результатов, а поэтому встала задача разработки новых и эффективных методов регистрации и определения данных газов в указанном процессе.
Обратимость электрохимической реакции на платине по кислороду. В 1966 году нами была выдвинута идея одновременной регистрации водорода и кислорода в растворе при помощи платинового электрода. При этом мы исходили из того положения, что поскольку данные газы создают противоположные по знаку потенциалы на платине, одновременное их присутствие в растворе должно создавать потенциал, пропорциональный отношению их концентраций. Эти предположения были полностью подтверждены при экспериментальной проверке идеи. Были получены строгие зависимости потенциала платинового электрода от величины Н2:О2 в дистиллированной воде, сложных электролитах /биологических средах/ и в бактериальной культуре. /4/
На рис.1 приведены результаты определений потенциала платинового электрода в зависимости от соотношения Н2:О2 для дистиллированной воды. Измерения проводили в стеклянной колбе, перемешивания жидкости в которой производили магнитной мешалкой. В колбу были введены игольчатый рt - электрод /d=0,5-1,0 мм, хотя толщина для подобных опытов несущественна/. Смесь Н2+О2 того или иного состава непрерывно продувалась сквозь раствор до тех пор, пока потенциал электрода становился неизменным. Такое значение потенциала мы принимали за равновесное. Изменение концентрации О2 от 5 до 95% и наоборот за счёт изменений концентрации водорода в смеси вызывало определённые смещения потенциала кривой зависимости потенциала от величины Н2:О2 по прямому и обратному пути.
На рис. 2 показаны изменения потенциала рt - электрода в зависимости от величины Н2:О2 в бактериальной суспензии. Из данных этого рисунка также следует строгое соответствие между потенциалом электрода и соотношением Н2:О2, хотя абсолютные его значения не совпадают с таковыми для воды. Это расхождение не принципиально, т.к. оно объясняется изменениями растворимости газов в зависимости от концентраций тех или иных компонентов раствора. Но и в данном случае ход кривой зависимости потенциала платинового электрода от концентрации О2, которая возрастала за счёт водорода, совпадая с ходом её при возрастании концентрации Н2 за счёт кислорода.
Следует подчеркнуть, что указанная закономерность имеет место всегда, если платиновый электрод чувствителен к Н2 и О2. Степень чувствительности при этом не влияет на обратимость электрохимической реакции на платине по кислороду в присутствии водорода. На это указывают данные рис.3, полученные для электрода, работавшего в биологической среде с бактериями несколько суток. Обратимость указанной реакции демонстрирует также рис.4, на котором изображена запись изменения потенциала платинового электрода под влиянием Н2 и О2 в случае, когда концентрации их в растворе непрерывно менялись за счёт неодинакового потребления бактериями.
Таким образом, приведённый экспериментальный материал показывает явление обратимости электрохимической реакции кислорода на платине в присутствии водорода и что это явление устойчиво во времени.
Независимость кислородно-водородного эффекта на платине от рН. Явление независимости обратимой реакции кислорода на платине в присутствии водорода от концентрации его ионов в растворе было вскрыто нами при разработке метода регистрации СО2 в культуре водородокисляющих бактерий по рН среды. Данное явление было для нас неожиданным, т.к. многочисленные данные по титрованию растворов указывают на полную зависимость потенциала платинновго электрода от рН раствора. Но в первых же опытах по титрированию бактериальной суспензии углекислотой с одновременной регистрацией величины Н2:О2 платиновым электродом мы получили результаты, которые было трудно принять за истинные. Но эти результаты воспроизводились из опыта в опыт и вместе с этим исчезали всякого рода сомнения.
На рис. 5 показаны кривые непрерывной записи показаний платинового и стеклянного электродов при изменении величины Н2:О2 и относительном постоянстве рН бактериальной культуры. Эти данные иллюстрируют полную независимость рН от потенциала платинового электрода, который менялся за счёт Н2 и О2.
На рис. 6 показаны независимые изменения рН при постоянстве потенциала платинового электрода, обусловленного неизменностью величины Н2:О2. Незначительные отклонения потенциала платинового электрода в момент добавления углекислоты обусловлены, вероятно, увеличением давления в колбе в данный момент, т.к. через некоторое время потенциал принимал исходное значение.
На рис. 7 показаны независимые изменения потенциала платинового электрода под влиянием СО2. Эти данные также подтверждают полную независимость электрохимического процесса на платине в присутствии Н2 и О2 от концентрации ионов водорода в растворе. Эти результаты, кроме того, указывают также и на то, что ионы водорода или гидроксильные ионы не всегда могут влиять на электрохимические процессы, проходящие на платине в присутствии более одного активного /по отношению к платине компонента в растворе/.
На основании изложенного экспериментального материала мы предполагаем, что при одновременном присутствии водорода и кислорода потенциал платинового электрода обуславливается обратимыми электрохимическими реакциями непосредственно на поверхности платины, для которых данные газы являются исходными. Причём, ни один из промежуточных компонентов этих реакций, вероятно, не может быть заменён по заряду на аналогичный компонент из раствора, окружающего платину.
Литература
1. Bottgez W.Z. phys.Chem.,24,253,1897.
2. Wzoblowa H., Rao M.Z. Damjanovic A.,Bockris J. J.Electroanalit. Chem.,15, 139, 1967.
3. Бейтс Р. Определение рН, теория и практика. "Химия", Л. 1968.
4. Золотухин Н.В. Изв. АН СССР, сер. биол. 3, 452, 1969.
5. Золотухин Н.В. Научн. докл.высш.школы, Биол. науки, 7, 142, 1969
Подпись к рисункам
Рис. 1. Зависимость потенциала платинового электрода от соотношения концентраций водорода и кислорода в дистиллированной воде.
Рис.2. Зависимость потенциала платинового электрода в бактериальной суспензии от соотношения Н2:О2 в газовой фазе.
Рис.3. Прямой и обратный ход кривой зависимости потенциала платинового электрода в фосфатном буфере после длительной работы электрода в биологических средах.
Рис.4. Изменения потенциала платинового электрода под влиянием кислорода и водорода.
Рис.5. Изменения потенциала платинового электрода под влиянием Н2 и О2 на фоне относительного постоянства рН биологической среды.
Рис.6. Изменения рН среды на фоне постоянства и потенциала платинового электрода, обуславливаемые постоянством величины Н2:О2 в среде.
Рис.7. Независимость изменений показаний платинового электрода при изменении концентраций Н2 и О2 и стеклянного электрода при изменении концентрации углекислоты в растворе.
Системно-кибернетические аспекты управления жизнедеятельностью клетки
Вопросы управления био процессами на всех уровнях организации биологических объектов в последние года обретают черты глобальной проблемы современного естествознания. В решение этих вопросов интенсивно вовлекаются, помимо биологов, физики, химики, математики, кибернетики, философы и др.
Проблема управления био процессами начала отчётливо формироваться во второй половине нашего века, когда с помощью физических, химических и других методов, был установлен потенциал структуры основной единен, живого - клетки, был открыт её генетический код, механизмы передачи генетической информации на уровне синтеза белков и преобразования энергии, вещества и информации внешних источников на внутриклеточные формы.
Известно, что именно клетки являются основными структурно-функциональными единицами всех представителей живого на Земле и они справедливо рассматриваются как элементарная форма живого, обладающая всеми свойствами живой материи, таковыми являются:
1) индивидуальность
2) метаболическая активность и адаптивная био способность
3) устойчивость
4) временная активность
5) способность нести информацию
6) обеспечение взаимодействия генетического вещества с гомеостатической подсистемой
7) рост и воспроизведение
8) исследование изменений (биосинтенция)
9) внутренняя саморегуляция, самонастраивание и самоуправление
10) эволюционная способность
Следовательно, в силу того, что всё живое на Земле имеет клеточное строение, всесторонние исследования индивидуальных, функционирующих клеток имеет первостепенное значение не только в общебиологическом плане, но и в плане назначения механизмов и систем управления, основ и принципов управления биологических систем управления, т.к. именно здесь открываются возможности сознательного воздействия на биообъект с целью получения желаемого результата. Это, как известно имеет огромное значение для медицины, сельского хозяйства, биоиндустрии, окружающей среды и ряда разделов техники.
По современным данным в живой природе существуют принципы универсальности. Например, универсален генетический код. Им располагают молекулы ДНК, которые построены из четырёх элементов, сложных органических соединений, именуемы нуклеотидами. Набор 3-х нуклеотидов образует триклет. Каждый триклет обеспечивает синтез определённой аминокислоты. Их в клетке около 20. Из этих 20 аминокислот синтезируются под контролем ДНК белковые молекулы. В настоящее время их известно около 3-х тысяч.
Универсальны также механизмы преобразования энергии внешнего источника у всех фотосинтезирующих, гетеро и автотрофных клетках, кроме того, универсальны механизмы многих биохимических, хемоосмотических, механо гимических и других реакций и процессов, обеспечивающих жизнедеятельность клеток различных биообъектов, будь-то микроб или человеческий организм, а также универсальна мембранная структура клеток.
Именно универсальность структурно-функционной организации клеток позволяет утверждать, что между микробом - кишечная палочка и слоном больше сходства, чем различия. Кроме того, на атомарном уровне всё живое построено из незначительного числа элементов периодической системы элементов. А именно: из углерода, азота, кислорода, водорода, фосфора и ряда микроэлементов, составляющих доли процента от общей массы биообъекта.
Но, не смотря на открытие универсальности структурной и функциональной организации биообъектов, многое в живой природе остаётся не понятным и не раскрытым. Это особенно касается функциональной организации.
По современным представлениям - любой биологический объект является мульти функциональной макросистемой состоящей из множества взаимо-связанных и взаимодействующих подсистем. В силу этого, последование биообъектов, на наш взгляд, с позиций системного подхода и анализа может дать качественно новые результаты.
Ранее уже говорилось, что в основе существования биообъектов лежат три основных процесса:
1. преобразование энергии
2. преобразование вещества
3. получение, передача и сохранение информации
Очевидно, что все эти процессы обеспечиваются работой соответствующих систем.
Биофизические основы жизнедеятельности клетки: системно - кинетические аспекты
1. Введение
Структурная и функциональная универсальность организации живой материи.
а) химические основы живого и почему живое строиться из ограниченного набора химических элементов.
б) биохимические компоненты живого
2. Клетка как полифункциональная, саморазвивающаяся, циклическая биологическая система.
а) основные функции клетки
б) основные системы клетки
в) цикличность функциональной организации клетки
г) работа энергетических систем клетки
д) синтезирующие системы
е) генетическая система
ё) взаимодействие клеточных систем
ж) мембраны в энергетике и синтезах клетки
3. Универсализм - основной закон существования и развития живых систем. Локальные механизмы регуляции гомеостаза клетки (параметры: Т, рН, еК, концентрации, скорости входа - выхода.
4. Кинетические аспекты жизнедеятельности клетки.
а) кинетическое совершенство - основой эволюционный ветер
б) ферменты - результат борьбы за быстроту к основе ускорения реакций в гомогенных образованиях
в) повторяемость воздействий внешнего (неорганического) мира на протобиологические системы
Первичных и повторяющихся воздействий их преобразование в материю и энергию формы внешнего мира. Является началом проявления актов жизнедеятельности
5. Устойчивое неравновесие биологических (открытых) систем и его роль в их эволюции (кинетическое совершенство).
Моделирование основ жизнедеятельности клетки.
а) физические модели
б) химические модели
в) материальные модели
г) биофизические модели
Водород и его особая роль в живой природе.
1. системная организация, обратные и прямые связи - основа управления и взаимодействия процессов в живой природе
2. фотосинтез - апаргосинтез - органосинтез - их единство и различия
3. обратная связь - основа саморегуляции и самоуправление внутриклеточных процессов
4. внутреннее и внешнее управление процессами жизнедеятельности
5. биофизическая модель фотосинтеза
6. синтез АТФ - как результат разрядки потенциала на мембране - конденсаторе?
Основы биотехнологии
Введение
К вопросу о повышении эффективности и промышленного биосинтеза
Н.В.Золотухин
Темпы развития той или иной отрасли народного хозяйства в настоящее время определяются в основном степенью использования в ней достижений соответствующих областей науки и техники. Это, в частности касается молодой, быстро развивающейся биологической промышленности, интенсивность развития которой прямо зависит от достижений различных разделов биологии и других отраслей науки и техники, обеспечивающих её экспериментальную базу.
Биосинтез, как известно, является сложнейшим, многокомпонентным автокаталитическим процессом. Его основу составляют непрерывный рост массы и численности составных компонентов клеток за счёт поглощения, переноса и трансформации ими веществ и энергии окружающего пространства в структурно-функциональные в свои элементы. Конечными продуктами данного биологического процесса являются различные классы веществ, наиболее ценными из которых для практических целей являются различные белки, аминокислоты, углеводы, липиды, нуклеотиды и другие соединения. Все эти вещества, как правило, являются составляющими компонентами живой природы и получения их химическим способом либо невозможно, либо крайне сложно и дорого.
Процессы увеличения массы клеток и последующее их деление, составляет основу различных биологических производств, начиная от промышленного получения массы одноклеточных организмов и кончая производством продуктов растительного и животного происхождения. Следовательно, во всех указанных производствах основным технологическим звеном является растущий биологический объект и поэтому он является самым главным звеном в любой отрасли биоиндустрии. В промышленном биосинтезе таковым являются дрожжи, бактерии, грибы и актиномицеты, и др.
В отличие от химической технологии, основу которой составляют химические реакции, проходящие в гомо - или гетерогенных макрофазах (реакторах, колоннах и пр.), биотехнология базируется на тысячах и миллионах различных элементарных и сложных реакциях и процессах, проходящих в микрообъёме, составляющем единицы или десятки кубических микрон, который и представляет та или иная живая клетка. Именно внутри клетки разыгрываются все те события, результатом которых являются вновь синтезированные различные органические молекулы и их ансамбли. Поэтому клетку можно рассматривать как пространство, в котором проходит вся совокупность реакций и процессов, составляющих биосинтез, находится ли это пространство в природных условиях, в пробирке или многокубовом промышленном аппарате - биологические свойства данного процесса, его природа остаются неизменными.
Из сказанного выше можно заключить, что для того, чтобы управлять таким сложным процессом, каковым является функционирующая, растущая клетка, необходимо знать те правила и законы, но которым осуществляется превращение сравнительно элементарных внешних веществ в разнообразные простые и сложные внутриклеточные соединения, структура и функция которых не имеет ничего общего с исходным материалом. С учётом же того, что в клетке могут одновременно функционировать сотни различных ферментов, катализирующих строго определённые реакции и процессы, а также и то, что в 1 мл. рабочей среды одновременно может находится несколько единиц и десятков миллионов функционирующих клеток, проблема управления промышленным микробиосинтезом представляется чрезвычайно сложной. Но тем не менее, наличие внутриклеточных механизмов регуляции биоэнергетических и биосинтетических процессов и систем клеточного самоуправления, значительно упрощает решение ряда практических задач. Рассмотрим это на конкретном примере.
Известно, что клеточные структуры состоят из атомов углерода, азота, кислорода, водорода, фосфора и мизерного количества других химических элементов. Следовательно, для воспроизводства структурных и функциональных компонентов в клетку в процессе её роста должны поступать либо сложные вещества, содержащие все указанные элементы, либо иметь место поступления данных элементов как таковых. Кроме того, для трансформации внешних источников структурных элементов, требующих, как правило, энергозатрат, в клетке должны быть в наличии необходимые источники энергии и соответствующие катализаторы - ферменты, при помощи которых осуществляются эти процессы.
Очевидно, что совокупность реакций и процессов по превращению веществ, поступающих из внешней среды, во внутриклеточные компоненты, можно назвать биосинтетической системой клетки. Работы данной системы, что также очевидно, будет зависеть не только от наличных концентраций ферментов; но и от доступных форм энергии, например, от концентрации АТФ в клетке. Данная форма "биологической" энергии, как известно, производится также системой реакций и процессов, именуемых биоэнергетическими.
Установлено также, что сложные процессы биосинтеза белковых соединений (ферментов и других) находятся под строгим контролем генетического аппарата или системы клетки, элементы которого (нуклеиновые кислоты) также являются продуктами биосинтетической системы.
Таким образом, любую живую клетку в первом приближении можно представить как сложную функциональную систему, состаяющую из 3-х взаимосвязанных и взаимозависимых функциональных подсистем. Схематично это представлено на рис. 1. Данная схема наглядно показывает, что с учётом самостоятельной работы внутриклеточных механизмов регуляции ростовых процессов (совокупности реакций и процессов по воспроизводству компонентов и структур клетки), управление ростом клетки сводится к регулированию потоков источников энергии углерода, азота, кислорода, водорода, фосфора и других элементов в клетку, т.е. к изменению или поддержанию их концентраций во внеклеточной среде.
На конкретном примере это осуществляется следующим образом. Известно, что для промышленного получения кормовых дрожжей широко используются гидролизаты растительного сырья, обогащённые соответствующими солями. Эта среда представляет собой водный раствор, содержащий все источники структурных элементов дрожжей, которые легко растворимы и концентрации которых поэтому в каждой точке любого объёма одинаковы. Но в данной среде отсутствует один из главных элементов питания дрожжей при аэробном росте - молекулярный кислород. Следовательно, чтобы каждая дрожжевая клетка могла функционировать в любой точке объёма данной среды, необходимо чтобы в ней также находился и молекулярный кислород. В силу того, что растворимость кислорода в данных средах крайне низка, его наличное количество поэтому резко ограничено. Наличие же диффузионного барьера в условиях слабо перемешиваемой среды в которой клетки легко переходят во взвесь, для активных дрожжей кислород будет единственным компонентом, от которого будет полностью зависеть работа всех 3-х систем клетки. Поэтому, в данном случае, чтобы индуцировать рост дрожжей и поддерживать его скорость на определённом уровне, необходима непрерывная доставка кислорода в любую точку, в которой находятся микробные клетки и поддерживать концентрацию данного компонента на требуемом уровне. Именно решению данной задачи подчинены практически все разработки по созданию наиболее оптимальной конструкции биореактора (ферментера) для получения биомассы и отдельных продуктов микробиосинтеза.
Но, как показывают результаты анализа технических решений по созданию новых биореакторов, они всё ещё достаточно сложны не только по конструктивному выполнению, но и по практической реализации. Кроме того, предлагаемые решения требуют значительных металло затрат, а сама работа аппаратов - больших затрат энергии, т.к. основной их конструктивной деталью являются перемешивающие устройства. Их же основная роль - не перемешивание микробной культуры, а смешивание жидкой фазы (культуральной среды) с газовой (воздуха или другого газа). В случае выращивания аэробных микроорганизмов в условиях промышленности газовую фазу в аппарате представляет воздух, служащий источником кислорода для дыхания дрожжей, т.е. для обеспечения непрерывности прохождения биоэнергетических реакций, от которых прямо зависит интенсивность биосинтеза.
Несмотря на то, что предложено множество вариантов перемешивающих устройств и способов, до сих пор не найдено такое решение, которое при максимальном обеспечении растущих микробных клеток кислородом для своей реализации требовало минимум энерго - и материалозатрат при высоком значении коэффициента наполнения аппарата (его полезного объёма).
В гидролизно - дрожжевом производстве, например, полезный объём аппарата (по монолитной жидкости) составляет 30-33%. Увеличение же этой величины, очевидно, соответственно повысит и удельную производительность аппарата. Но, к сожалению, техника используемая в настоящее время для обеспечения кислородом растущих крупно-объёмных микробных культур не позволяет этого сделать.
Но, как показывают результаты анализа технических решений по созданию новых биореакторов, они все ещё достаточно сложны не только по конструктивному выполнению, но и по практической реализации. Кроме того, предлагаемые решения требуют значительных металло затрат, а сама работа аппаратов - больших затрат энергии, т.к. основной их конструктивной деталью являются перемешивающие устройства. Их же основная роль - не перемешивание микробной культуры, а смешивание жидкой фазы (культуральной среды) с газовой (воздуха или другого газа). В случае выращивания аэробных микроорганизмов в условиях промышленности газовую фазу в аппарате представляет воздух, служащий источником кислорода для дыхания дрожжей, т.е. для обеспечения непрерывности прохождения биоэнергетических реакций, от которых прямо зависит интенсивность биосинтеза.
Несмотря на то, что предложено множество вариантов перемешивающих устройств и способов, до сих пор не найдено такое решение, которое при максимальном обеспечении растущих микробных клеток кислородом для своей реализации требовало минимум энерго- и материалозатрат при высоком значении коэффициента наполнения аппарата (его полезного объёма).
В гидролизно-дрожжевом производстве, например, полезный объём аппарата (по монолитной жидкости) составляет 30-33%. Увеличение же этой величины, очевидно, соответственно повысит и удельную производительность аппарата. Но, к сожалению, техника используемая в настоящее время для обеспечения кислородом растущих крупнообъёмных микробных культур не позволяет этого сделать. Это особенно касается гидролизных сред, интенсивное перемешивание которых создаёт мощную пенную фазу. Этот факт вынуждает строить аппараты колонного типа, т.е. с повышенными затратами металла на его высоту.
Исходя из того, что микробные клетки даже при лёгком встряхивании легко переходят во взвешенное состояние. Нами были исследованы возможные пути обеспечения в таких условиях растущих микроорганизмов кислородом без интенсивного перемешивания жидкости. На основе этих исследований мы пришли к выводу, что наиболее эффективный способ доставки кислорода к местам роста микроорганизмов в жидкой среде является доставка его в виде мелких пузырьков с нижней части аппарата в верхнюю. На этом принципе нами был разработан и изготовлен аппарат, схематичное устройство которого показано на рис.2.
Аппарат представляет собой цилиндрическую ёмкость с коническим днищем. К вершине днища имеются подводы для питательной среды и воздуха. Коническое днище при этом разделено перфорированной перегородкой, над которой расположен один или несколько барботеров, имеющими автономные подводы воздуха. Основанием цилиндра и конуса также служит перфорированная перегородка.
В цилиндрической части аппарата в несколько ярусов расположены перфорированные диски, имеющие зазоры между своими краями и стенкой ёмкости. В верхней части аппарата имеются выходы для микробной суспензии и газов.
Как следует из приведённого описания, аппарат по конструкции прост и не имеет в себе ни вращающихся механизмов, ни теплообменных устройств.
Аппарат работает следующим образом. В нижнюю часть непрерывно под давлением поступают жидкая питательная среда и газ (воздух), где предварительное смешение. Далее жидкость и газ поднималась вверх диспергируется первым плоским перфоэлементом. Барботер, размещённый выше, дополнительно насыщает первичную газо-жидкостную смесь газом, а перфоэлемент находящийся в основании цилиндра производит дальнейшее диспергирование среды и газа. В силу того, что по мере продвижения вверх пузырьки газа могут сливаться и, тем самым, уменьшать поверхность контакта газа с жидкостью, на пути их движения находятся перфодиски. Последние также выполняют роль мешалок, т.е. осуществляют не только перемешивание, но и циркуляцию микробной суспензии по контуру "верх-низ-верх". Данная циркуляция осуществляется за счёт непрерывного подъёма жидкости газом и наличие зазоров между краями дисков и стенкой аппарата, через которые жидкость как бы проливается вниз. Циркуляция жидкости при этом поддерживает клетки во взвешенном состоянии, а непрерывный коток воздуха через перфосистему аппарата обеспечивает их кислородом, поглощаемого в процессе роста.
Данная конструкция аппарата ёмкостью 1200 л. была испытана в условиях Янгиюльского биохимического завода. При этом были использованы производственные среды и штаммы дрожжей. Кстати, среды на данном заводе имеют серьёзный недостаток, т.к. представляют собой смеси гидролизатов опилок, хлопковой шелухи и рисовой лузги, соотношение которых всё время меняется. Эти изменения соответствующим образом сказываются на скорости роста микроорганизмов.
Тем не менее, эксперименты показали, что и в этих условиях рабочий объём аппарата был доведён до 90%, а время удвоения биомассы составляло 1,5-3,5 часа. Такое изменение последней величины, очевидно, можно отнести на счёт непостоянства соотношения различных сахаров в среде.
Кроме того, было установлено, что в периодическом или непрерывном режиме выращивания дрожжей в данном аппарате процесс пененея микробной культуры практически сводится к нулю. Именно является основой значительного увеличения полезного объёма аппарата и его удельной производительности. А в силу того, что жидкая и газовая среда при определённом и постоянном давлении, а выход дрожжевой суспензии находится вверху, отпадает необходимость в насосах другого технологического оборудования для подачи среды и поддержание её в аппарате на заданном уровне.
Что касается поддерживания необходимой температурного режима в аппарате, то это осуществляется путём изменения температуры среды на её входе в аппарат.
Продолжительность опыта 24 часа.
V=50м3
1. Промыть и пропарить аппарат. Сделать это утром.
2. Через малый аппарат из стерилизатора закачать сусло до нижнего пробоотборника. Затем разбавить водой до концентрации рВ 0,7-0,8%. Общий объём среды - 15м3.
3. Включить воздух, довести рН и Т до оптимальных значений.
4. Далее работать в режиме накопления биомассы с периодическим добавлением сусла из стерилизатора. Объём довести до 32 м3, а рВ до 0,15-0,20%.
5. Все данные и замечания вносить в рабочий журнал.
0,3мм*106 3 3000мм.
Программа (биофизика клетки)
1. Химические основы живого
2. Биохимические компоненты жизни
3. Клетка - универсальная единица жизни
4. Мембраны - основные структурные единицы организации клетки
5. Основные микро-системы клетки
6. Микросистемы клетки (динамические)
7. Циклы - основа динамической организации жизни
8. Универсализм как основа, закон существования живых систем
9. Обратная связь - основной механизм самоуправления и саморегуляции
10.Биофизическая модель фотосинтеза
11. Преобразование энергии в живых системах (мембрана как конденсатор)
12. Регенеративные системы как хранители, трансформаторы и переносчики наследственной информации
1. Жизнедеятельность клетки как объект управления
2. Простой аппарат для выращивания аэробных микроорганизмов
3. Ростовые процессы клетки как объект управления
4. Микробиосинтез как объект моделирования и управления
5. Промышленный микробиосинтез: проблемы управления
6. Биофизическая управляемая модель фотосинтеза
7. Биоэнергетическая система клетки как объект управления
8. К вопросу управления микробносинтезом
9. Математическая модель микробиосинтеза
10. Анализ работы энергетической системы клетки с целью моделирования и управления
11. К вопросу алгоритмизации процесса управления микробиосинтезом
12. Системно-кибернетические аспекты основ управления в процессах жизнедеятельности
13. Клетка как полифункциональная самоуправляемая система
14. Системная организация, обратные и прямые связи - основа управления в живой природе
15. Кинетические аспекты управления жизнедеятельностью клеточной популяции
16. Обратная связь - основа регуляции кинетики внутриклеточных процессов
Темпы прогресса в той или иной сфере практической деятельности людей определяются, в основном, степенью использования ими последних достижений соответствующие областей науки и техники, начиная с момента конечного "оформления" научной и технической идеи. Кроме того, данные темпы прогресса зависят и от скорости развития самих науки и техники. Так, например, возникновение за последние 20-30 лет технических наук, как кибернетические и молекулярно-биологические не только коренным образом изменили наши представления об окружающей нас мире, но и очень мощно повлияли на теоретические и прикладные исследования сложнейших процессов, происходящих в живой и неживой природе и внедрение их в практическую деятельность. Кроме того, возникновение новых областей науки является не только следствием её непрерывной дифференциации, но и основой интеграции отдельных областей её знаний. При этом, как правило, на стыке разных областей науки возникают новые. Например, примерно за последние два десятилетия возникли такие науки биофизическая химия, биоорганическая химия, биокибернетика, теория биосистем и другие. Кроме того, по мнению учёных разных направлений наиболее перспективными и наиболее актуальными являются последования живой природы, начиная с её атомарно-молекулярной организации, отдельных реакций и процессов в живой клетке и кончая глобальными процессами - взаимодействие живой природы с планетой Земля и космосом.
Как показывают результаты комплексных исследований организации и "работы" живой природы на всех уровнях и взаимодействие её с окружающим миром, у человека имеются огромные возможности безгранично и сознательно управлять не только функционированием биологических объектов различных, так сказать, размеров, но и влиять на их взаимодействие между собой и окружающей средой. Этим самым мы, земляне можем значительно и непрерывно повышать не только наши духовные силы, но и ликвидировать тяжёлые болезни, дефицит самых разных питательных и кормовых продуктов, значительно улучшить окружающую нас природу и т.д. Например, по данным ЮНЕСКО в настоящее время около 50% населения Земли испытывают белковый голод. При этом предлагаются различные решения этой острой проблемы. Одним из них, по мнению компетентных специалистов является индустриальный способ получения питательных веществ для сельскохозяйственных животных, а через них - и для человека.
Разработка бесфлотационной биотехнологии получения из гидролиззенов растительного сырья и её аппаратурного оформления
Недостатки действующей технологии. Производство кормового белка и других физиологически активных веществ является наиболее перспективным, т.к. исходное сырьё является практически неисчерпаемым в силу своего постоянного воспроизводства в живой природе.
Хотя гидролизное производство с одновременным получением дрожжей организовано в нашей стране ещё в 30-х годах нынешнего века, оно в основном мало претерпело существенных технологических изменений. Эффективность же биотехнологии получения дрожжей из гидролизатов растительного сырья по-прежнему остаётся низкой. Объём же производства дрожжевой массы продолжает расти за счёт ввода дополнительных мощностей, но не за счёт новой, научно обоснованной технологии.
Действующая биотехнология дрожжевого производства имеет ряд существенных недостатков , а именно:
- неустойчивость процесса микробиосинтеза во времени;
- низкая удельная производительность аппаратов из-за малого коэффициента аппаратов из-за малого коэффициента их наполнения (около 30%) рабочей средой и низкой концентрации основного субстрата - сахаров (около 0,8 %);
- высокие до (5-10%) потери основной продукции и других веществ на стадии выращивания дрожжей и выделения их из рабочей среды;
- значительные затраты энергии на аэрацию дрожжевой культуры, которая (аэрация);
в основном тратится на долактацию дрожжей в аппарате, представляющую собой поддержание в аппарате мощной пенной фазы;
- значительные затраты пеногасителя на возврат дрожжей в жидкую фазу на стадии их сгущения при сепарации;
- из-за наличия пенной фазы в аппарате его полезный объём (по монолитной жидкости) составляет около 30%;
- большие потоки сточных вод с высокими значениями ХПК и БПК приводит к загрязнению определяющей среды.
Но основными недостатками действующей технологии получения дрожжевой массы является отсутствие основ управления скоростью роста и качеством биомассы, например, стабилизации содержания в ней белковых веществ.
Пути повышения эффективности дрожжевого производства.
Последние решения и постановления Партии и Правительства, как известно, направлены на ускорение научно-технического прогресса и широкого внедрения достижений науки и техники в народное хозяйство. При этом особое внимание уделяется разработкам новых технологий и средств их автоматизации.
В отличие от химической, биотехнология получения микробной массы в промышленных условиях основана на множестве реакций и процессов, проходящих внутри микробной клетки и обеспечивающих синтезы всех её компонентов, т.е. непрерывный прирост массы белков, витаминов, липидов, углеводов и т.д. Поэтому для сознательного ведения микробиосинтеза, очевидно, необходимы не только знания механизмов внутриклеточных процессов и реакций, но и способы воздействия на эффективность их работы, т.е. управления ими.
Известно, например, что недостаток в среде источника азота или молекулярного кислорода стимулирует синтезы липидов и снижает скорость роста клеток вплоть до полной их остановки. Недостаток же источника энергии и углерода резко меняет морфо-физиологические свойства клеток. Это, вероятно, является одной из причин долатации дрожжей.
Как показывают результаты литературных и наших теоретических и экспериментальных исследований, любая клетка представляет собой большую сложную систему, состоящую из множества взаимосвязанных и взаимозависимых подсистем. Не смотря на такую сложность организации живой клетки, современные научные методы позволяют детальное их исследование с целью выявления их функциональных основ и разработки способов управления работой как отдельных внутриклеточных систем, так и жизнедеятельностью клетки в целом.
При этом наиболее эффективные результаты получаются в исследованиях "узких" мест во внутриклеточных реакциях и процессах. Одним из таких узких мест в рассматриваемом производстве кормовых дрожжей является концентрация растворённого кислорода в питательной среде, поскольку этот технологический параметр является наиболее консервативным из-за трудной растворимости данного газа в жидких средах. А поскольку кислород является одним из основных участников в энергетике аэробной клетки, постольку его значения могут быть определяющими в интенсивности не только усвоения энергии внешнего источника, но и в количественных и качественных параметрах микробиосинтеза. Иными словами, как энергетика, так и биосинтез аэробной клетки находятся в прямой зависимости от наличных концентраций кислорода в клетке. Отсутствие кислорода в среде вызывает процесс сбраживания сахара дрожжевыми клетками в спирт, а его присутствие - индуцирует ростовые процессы.
Следовательно, одним из путей повышения эффективности дрожжевого производства является разработка способов стабилизации концентрации растворённого кислорода в питательной среде.
На основе исследований кислородного режима питания дрожжей в условиях Янгиюльского биохимического завода, нами совместно с заводом был разработан способ равномерного распределения кислорода воздуха по сечению растительного аппарата и на его основе была создана новая конструкция ферментера.
Сущность его заключается в том, что газ (воздух) подаётся в вершину конической части днища аппарата и по мере его продвижения вверх он дробится на мелкие пузырьки с помощью плоских перфоэлементов. Такая доставка воздуха в рабочий объём ферментера даёт возможность обеспечения максимального количества микробных клеток кислородом и, следовательно, снять при этом те ограничения процесса по кислороду, которые имеют место в действующих промышленных аппаратах.
Вторым путём повышения эффективности промышленного микробиосинтеза является нахождение оптимальных концентраций сахаров, источников азота, фосфора и других элементов и поддержание их значений в необходимой областью Этим путём можно выявить и условия, действующие на качественный состав биомассы.
Для случая стабилизации ростовых процессов клетки, нами был разработан новый способ приготовления питательно среды для культивирования микроорганизмов. \на данный способ получено авторское свидетельство на изобретение.
Данный способ приминеним практически для большинства микроорганизмов, используемых в микробиологической промышленности, и прост в своей практической реализации. Кроме того, он не требует сложных методик, расчётов и моделей и может быть реализован в достаточно короткие сроки.
Третий путь повышения эффективности дрожжевого производства - применение высококонцентрированных питательных сред (напр., с содержанием РВ 2-6%). Использование таких сред позволит соответственно увеличить рабочую концентрацию дрожжей и удельную производительность аппаратов. Например, при использовании питательной среды с содержанием РВ 2% и выходе дрожжей 50%, удельная производительность аппарата составит 2,5 кг/м3 жидкости/час. Иными словами, аппарат с рабочим объёмом 500 м3 может дать 30т. дрожжей в сутки.
Использование высококонцентрированных сред не только резко повысит удельный "объём" биомассы с единицы объёма аппарата, но и снизит количество сточных вод на единицу готовой продукции вплоть до их полного исключения за счёт возврата на стадию гидролиза исходного сырья. Осуществление такого замкнутого цикла по жидкости резко снизит вредное воздействие микробиологического производства на окружающую среду.
Вполне очевидно, что решение основных задач по повышению эффективности дрожжевого производства предусматривает и разработку соответствующих средств автоматизации, способов и систем управления микробиосинтезом. В этом направлении работы продолжаются в плане учёта специфики биологического звена в биологическом узле (биореактора, ферментера) промышленного микробиосинтеза.
Практические результаты по усовершенствованию биотехнологии дрожжевого производства.
Основным методом исследования таких сложных технологических процессов, каковым представляется микробиосинтез, на наш взгляд, является системно-кибернетический подход. Сущность его заключается в рассмотрении микробной клетки как сложной динамической системы по превращению внешних источников энергии и вещества и реализации наследственной информации, заложенной информации, заложенной в генетическом материале - нуклеиновых кислотах. В случае исследования автосинтеза биомассы дрожжевыми и другими клетками, вероятно, можно ограничиться выделением основных внутриклеточных систем, установления связей между ними и эффективности работы каждой из них в зависимости от значений входных и выходных параметров для конкретной системы.
Системно - кибернетический подход в микробиосинтезе позволил нам разработать новый способ приготовления питательной среды, которой был уже испытан в условиях ЯБЗ, т.е. на примере смешанных гидролизатов растительного сырья. Этот способ, в частности открыл возможность бесфлотационной биотехнологии производства кормовых дрожжей. Сущность этой технологии заключена в следующем.
Необходимым условием для её осуществления является выращивание микроорганизмов в жидкой фазе ( в водном растворе питательных компонентов - источников энергии, углерода, водорода, азота, фосфора и микроэлементов), насыщенной растворённым кислородом. Дрожжевая масса, полученная в таких условиях, становится тяжелее воды и поэтому легко выпадает в осадок. Это даёт возможность значительно снизить затраты, например, на осаждение, заранее уже сфлотированных, дрожжей. Кроме того, здесь, по-видимому, появляется возможность снизить затраты энергии и материалов на стадии отделения дрожжей от отработанной среды. Реализация же данной технологии даёт возможность упростить технологическую линию, сделать её удобной, а легко контролируемой в эксплуатации и исключающей потери целевого продукта на стадиях выращивания и выделение дрожжей из рабочей среды, т.к. данная технология даёт возможность дрожжам самоосождаться.
Как показали испытания в лабораторных (аппарат ёмкостью 10л с перфорированной системой воздухораспределения) и опытных (аппарат ёмкостью 1200л), бесфлотационная технология требует выполнения следующих условий:
- среда, поступаемая в дрожжерастительный аппарат, должна быть постоянного состава;
- расход воздуха, вернее, кислорода должен также находится в определённых пределах.
Выполнение этих условий практически исключает вспенивание среды и сопряжённую с ней флотацию дрожжей.
Результаты. Испытания бесфлотационной технологии в аппаратах ёмкостью 1,2 и 50 м3
Целью испытания бесфлотационной технологии в аппаратах различной ёмкости была проверка адекватности результатов, полученных в каждом из них.
После создания малого аппарата (1977-78 гг.), его испытания проводились с использованием, так называемого, "приточного" сусла (концентрация сахаров 0,8-0,9%). Оно представляет собой гидролизат (концентрация сахаров около 1,8%), разбавленный водой и послеспиртовой бражкой. Почти все первые эксперименты заканчивались заражением основной дрожжевой культуры посторонней микрофлорой. Продолжительность этих экспериментов составляла несколько десятков часов.
Исходным (посевным) материалом служили дрожжи, взятые из промышленных аппаратов.
Причинами заражения дрожжевой культуры в первоначальных экспериментах, по-видимому, были: нестерильный воздух ( в то время мимо воздуходувок было интенсивное движение транспорта), а также нестерилизуемые трубопроводы и запорная аппаратура.
После многократной "обкатки" добились того, что чистота культуры могла поддерживаться в течение нескольких суток. Тем не менее, имело место частое, а иногда и постоянное вспенивания дрожжевой культуры, которое устраняли добавкой незначительных (5-10мл) на 1 м3, дрожжевой культуры в час количеств рабочего жира.
Концентрация дрожжей в этих опытах достигала 10-15 г/л при концентрации остаточных сахаров 0,10-0,20%. Следующая серия опытов проводилась в иных условиях. Исходными дрожжами были чистая культура, выращенная в лабораторных условиях. Питательной средой служил неразбавленный нейтрализат с содержанием сахаров около 1,8%, обогащённой солями по регламенту, принятому в данном производстве на ЯБЗ.
Во всех этих опытах получались устойчивые высококачественные результаты. А именно: рост дрожжей активный (время удвоения биомассы от 2,5 до 4 часов, см. рис. 1, устойчивая и "хорошая" морфологическая картина дрожжей. Причём, вспенивание дрожжевой культуры, как правило, наблюдалось при нарушении режима аэрации.
Данные результаты были подтверждены технологами дрожжевого цеха, которые после этого приняли аппарат (ёмкостью 1,2 м3) в постоянную эксплуатацию вместо 2-х прежних дрожжей растительных аппаратов, работавших в начале технологической линии (отделение чистой культуры) после пуска дрожжевого цеха в эксплуатацию.
Таким образом, применение перфорированной системы воздухораспределения в аппаратах для производства кормовых дрожжей из гидролизатов растительного сырья дало положительные результаты и на 2-ом этаже объём аппарата 1,2 м3, т.е. в объёме аппарата, превышающем исходный (лабораторный, V=10л) в 120 раз здесь также, как и в исходном варианте, полезный объём достигал 70-80% от общего, что в 2 с лишним раза выше принятых к настоящему времени на действующих гидролизно-дрожжевых производствах. Эти результаты затем (1979) были обсуждены со специалистами ВНИИгидролиз и "Союзгидролизпром", где они получили высокую оценку. Там же было рекомендовано изготовить аппарат, приближённый к промышленному образцу.
В 1980 году, после обсуждения перспективы развития данного направления, руководством ЯБЗ и ИК с ВЦ АНУзССР было принято решение об изготовлении аппарата с перфорированной системой воздухо распределения ёмкостью 50 м3 из листовой нержавеющей стали. При поддержке РС СНТП при ЦК КП Узбекистана эти работы были начаты ОЭЗ Уз НПО "Кибернетика", СМНУ "Средазмикробиопром" и ЯБЗ. В 1980 г.
В 1981-82г. аппарат ёмкостью 50м3 был изготовлен и испытан на воде и на рабочей среде. Было отмечено, что распределение воздуха по сечению аппарата вполне удовлетворительное.
Во время испытаний с дрожжевой культурой эта равномерность нарушалась. Как выяснилось позже, при интенсивном аэрировании дрожжей крепления некоторых сегментов были сорваны и в этих местах образовались щели. Крепления эти затем были усилены.
В дальнейшем испытания велись с учётом морфологического состояния дрожжей и расхода воздуха. Многочисленными экспериментами было показано, что расход воздуха при активном росте дрожжей составляет 15-25 м3 на 1 м3 дрожжевой. культуры против 50, принятых для промышленных аппаратов. Это указывает на то, что затраты энергии на аэрацию в данном случае в 2-3 раза ниже.
Тем не менее, во всех экспериментах имело место эпизодическое вспенивание вплоть до выброса пены из аппарата. В 1984 году, на основе анализа причин пененея были выдвинуты и реализованы предложения об отборе дрожжей с 2-х уровней. Но тем не менее, работая на приточном сусле, мы получали с переменным успехом как положительные, так и отрицательные результаты при фиксированных значениях рН и Т.
В дальнейшем было решено оснастить аппарат специальной пеногасящей системой. Она представляет собой контур:натрубок от нижней цилиндрической части аппарата - насос - патрубок, входящий в верхнюю часть аппарата на высоте примерно 5 м. - разбрызгиватель жидкости. При помощи этой системы осуществляется интенсивное струйное орошение поверхности дрожжевой культуры рабочей жидкостью, отобранной насосом из нижней части аппарата.
Из-за отсутствия свободных насосов в дрожжевом цехе и на заводе полное изготовление данной системы затянулось до 16 мая 1985 г., когда насос был наконец найден. В мае- система была испытана на воде и сусле. В июне во время испытаний с растущими дрожжами электро двигатель насоса вышел из строя. Замена двигателя на менее мощный (4,5 квт против 7,5 квт) не дала положительных результатов. После дополнительных поисков, был найден новый электронасос с водяным охлаждением, которое значительно снижает степень нагрева двигателя. Данный насос оказался надёжнее первых двух. Испытания пеногасящей циркуляционной системы с новым насосом показали, что полного орошения поверхности дрожжевой культуры не происходит. Поэтому силами дрожжевого цеха также были иные разбрызгиватели. Всего сейчас их 9 шт. Но, к сожалению, их конструкция не совсем удачна.
После обновления некоторой запорной арматуры испытания были продолжены уже в сентябре этого года. Бесфлотационная технология в дальнейшем испытывалась одновременно на малом и большом аппаратах. При использовании концентрированного нейтрализата в обоих случаях имело место эпизодическое, лёгкое вспенивание дрожжевой культуры (см. например опыты от 23-25 октября). При переходе с концентрированного на приточное сусло в большом аппарате начиналось пененее, которое гасилось пеногасящей системой. При этом, в конечном итоге, наблюдали постепенное скопление дрожжей в верхних слоях рабочей жидкости до 45 г\л. Можно полагать, что в данном случае такое поведение дрожжевой культуры обусловлено приточным суслом, состав которого во времени может резко меняться из-за различных режимов разбавления нейтрализата водой и послеспиртовой бражкой. Во всех опытах, проведённых на малом и большом аппаратах в сентябре - октябре 85г, наблюдали типичные для обоих аппаратов картины. А именно: при использовании активного посевного материала всегда (рис.1) имела место активное использование дрожжами сахаров, их непрерывный рост при хорошей форме клеток на неразбавленном нейтрализате. В последнем случае эти показатели сохранялись до тех пор, пока вместо концентрированной среды не подавали разбавленной среды не подавали разбавленную. Возможно, что при нормальных значениях рН и Т, нарушения процесса на приточном сусле происходили из-за добавляемого пеногасителя, который, в свою очередь, бывает различного качества.
Мы утверждаем, что в заявлении указаны все без исключения действительные авторы данного изобретения и что в связи с этим после принятия Государственным комитетом Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий настоящей заявки к рассмотрению никакие другие лица не будут включаться в состав авторов. При этом нам известно, что соавторами изобретения могут быть только лица, внесшие творческий вклад в создание изобретения и что включение в соавторы лиц, не принимавших участия в творческой работе по созданию изобретения, влечёт за собой ответственность в порядке определяемой законодательством союзных республик.
Нам известны права и обязанности, вытекающие из положения об частности, что разглашение сущности данного изобретения впредь до соответствующего разрешения не допускается и переписка.
Реализовать возможно, только после того, как я стану президентом России.
проект отца
© Copyright: Артём Николаевич Золотухин, 2024
Свидетельство о публикации №224020800197
Свидетельство о публикации №224020800197
Рецензии