Размышления о бактериофагах. Часть 2

Часть II. Симбиоз: Бактерия - бактериофаг

В последней монографии “Бактериофаг и феномен выздоровления” Д’Эрелль подытожил все свои исследования по бактериофагу, а начал их с описания последнего уникального опыта длительностью 40 месяцев, которому посвятил пять лет (1929-1933 гг.) работы в Йельском университете (США). Он пытался найти ответ на постоянно занимающий его вопрос: как бактерии становятся носителями бактериофага и к чему это приводит. Цель опыта состояла в искусственном создании мутантов и изучении их свойств.
 
Для работы был взят только один штамм сальмонеллы энтеритидис, характеризующийся стабильной вирулентностью и только один бактериофаг с очень высокой вирулентностью к этой культуре. Десять одинаковых пробирок с бульонной культурой и бактериофагом оставляли при комнатной температуре. Через сутки содержимое всех пробирок было абсолютно прозрачным. Через 20 дней остались прозрачными только 4 пробирки, остальные 6 помутнели в результате вторичного роста. Это те самые микробы,  которые не подверглись разрушающему действию бактериофага и стали его носителями (лизогенными). Для работы была выбрана одна пробирка с нежным опалесцирующим ростом.   Из нее сделали высев на 18 чашек Петри. С них было отобрано восемь вариантов мутантов, позднее добавили еще два. Эти культуры пересевали ежедневно в течение 200 дней, а затем один раз в неделю в течение двух лет. Таким образом, каждый мутант прошел через 400 пассажей в течение 40 месяцев. Исследование свойств мутантов поводили через 10, 100, 150 дней и через 40 месяцев. У них исследовали: 1) чувствительность к исходному бактериофагу; 2) способность фильтратов их фаголизатов лизировать разные штаммы сальмонелл; 3) вирулентность в опытах на мышах; 4) агглютинационную и аглютиногенную активность; 5) отношение к комплементу в присутствии и отсутствии амбоцептора.

На протяжении пятидесяти пересевов все мутанты сохраняли резистентность к бактериофагу, на основе которого были получены. В конце опыта (40 недель) только один вариант сохранил устойчивость к исходному фагу, как в жидкой среде, так и на агаре. Все остальные эту способность утратили, однако отличались друг от друга и от исходного штамма по количеству негативных колоний и способности образовывать вторичные культуры.

Исследование вирулентности полученных штаммов-мутантов на мышах показало, что у двух штаммов вирулентность сохранялась как у исходного, однако по другим свойствам они от него отличались. У двух штаммов вирулентность значительно снизилась, 3 штамма стали полностью авирулентными и только один штамм оказался способным вызывать хроническую болезнь.

Результаты этих исследований с подробным описанием и протоколами опытов приведены в его последней монографии, которая первоначально была опубликована на русском языке в Тбилиси (1935 г.), а затем на французском в Париже (1938 г.), а также в трех статьях по мутации (США, 1932-1934), указанных в библиографии к монографии.
 
Основной вывод, сделанный Д’Эреллем из этого опыта – под действием бактериофага меняются не только бактерии, но и сами бактериофаги, вызвавшие их. По его словам: «Самым примечательным является не сам факт сожительства двух живых существ, а те резкие перемены, которые возникают в свойствах двух живых особей, вступающих в симбиотическую связь». Только один бактериальный штамм и только один бактериофаг, а какое многообразие полученных новых форм.

Д’Эрелль отмечал, что такой изменчивостью, как бактериофаги не обладает ни один живой организм. Еще в 20-е годы он раздал ряду бактериологов образцы одного и того же Шига-бактериофага. Через несколько лет он попросил от них те же самые бактериофаги и убедился в том, что их свойства очень отличались как друг от друга, так и от первичной расы, которую он сохранил.
 
Исторически так сложилось, что когда после 20-летних споров о природе бактериофага была доказана правота Д’Эрелля, что бактериофаг – живое существо, с 40-х годов прошлого столетия лидерами в изучении фагов стали американские исследователи. Были заложены основы молекулярной генетики. И до настоящего времени связь бактерий с фагами рассматривается в основном с генетическим уклоном. Для Д’Эрелля же это был симбиоз. И более поздние исследователи не отрицали такой связи. Так Адамс отмечает “лизогения способствует выживанию и фага и клетки-хозяина”, а это уже симбиоз. По образному выражению Стента “бактериофаг не всегда рубит сук, на котором сидит”, и отождествляет лизогенное состояние бактерий с симбиозом. Однако исследования в этом направлении до сих пор не получили своего должного развития.

Д’Эрелль рассматривал симбиоз бактерия-бактериофаг лишь как частный случай общебиологического и прекрасно изученного ботаниками явления. Он приводит высказывания русского ботаника Еленкина: “Концепция прочного соотношения сил в симбиозе должна быть заменена концепцией неустойчивого равновесия. Два ассоциированных организма реагируют различно на условия внешней среды и на их изменения. Эти последние не одинаково благоприятны для обоих симбионтов…в зависимости  от обстоятельств или один или другой из них будет доминировать. Эти изменения должны оставаться в пределах, позволяющих существовать обоим организмам”.

Если слово лизогения означает лишь потенциальную способность бактерий к лизису за счет присутствующего в них профага, то симбиоз это уже функционирование нескольких живых существ как единое целое. Описанная в первой части данной статьи вариабельность токсинообразования в производстве анатоксинов лучше объяснима как проявление симбиоза.

Для получения токсина в производстве анатоксина Эдемантинс был использован штамм Клостридиум Эдемантинс А-79, продуцирующий альфа-токсин, который по молекулярному весу и летальной активности уступает только ботулическому и столбнячному токсину. Помимо этого в культуральной жидкости нами были обнаружены ферменты патогенности: гемолизин – 95%, лецитиназа – 80%, липаза – 56%, желатиназа – 7%, в концентрированных токсинах – глалуронидаза. При электронно-микроскопическом исследовании токсинообразования Кл. Эдемантинс типа А (Смирнова Т.А. с соавторами 1973 г.) отметила наличие у данной культуры дефектной лизогении, так как типичных фаговых частиц в лизированных клетках обнаружить не удалось.

Уже в 70-е годы прошлого века на широкое распространение у стрептококков как полноценной так и дефектной лизогении указывал Тополян А.А.

При знакомстве с архивными материалами Д’Эрелля (его воспоминания от 1940 г.) поражает его удивительная прозорливость. Сравнивая вирулентность бактериофага и вирулентность патогенных бактерий он отмечает , что по природе своей они аналогичны. И об этом он писал уже в 1925 г. Безусловно, живую ткань может поражать только лизогенная культура или же вырабатываемый ею токсин, который подобен бактериофагу. Так один из белков молекулы дифтерийного токсина представлен белком бактериофага.

Без признания, как неоспоримого факта того, что патогенность бактерий связана с бактериофагами, и процесс этот затрагивает не только перемещение генов, но и создает динамическое равновесие, реагирующее как на внутренние так и на внешние факторы, невозможно объяснить многих особенностей как болезней так и эпидемий (сезонность, цикличность, спонтанное выздоровление).

В лизогенных культурах связь бактерий с профагом может иметь разную степень прочности. Не это ли должно быть положено в основу классификации бактерий на условнопатогенные (у которых эта связь очень лабильна) и патогенные (с прочной связью). Да и сама градация факторов патогенности (от истинных токсинов до ферментов) должна быть основана на степени участия их в синтезе генома профага. А таких данных уже много.

В ботанике симбиоз хорошо изученное, но редко встречающееся явление. В микробиологии лизогенное состояние бактерий (симбиоз бактерии-бактериофаг) настолько широко распространено, что уже вряд ли кто из современных исследователей фага будет оспаривать пророческое высказывание Д’Эрелля, сделанное им в 1935 г.: «Должно казаться достойным удивления не то, что существуют штаммы бактерий носителей бактериофага, а то, что не все бактерии являются их носителями».

Многие из применяемых в настоящее время физиотерапевтических методов лечения инфекционных заболеваний направлены на вычленение профага из микробов путем индуцирующего действия извне. В связи с этим особый интерес представляет спонтанное выздоровление.  Д’Эрелль описал такой случай, свидетелем которого был сам в 1927 году, когда изучал эпидемию холеры в Индии. В госпиталь Кемпбеллис в Калькутте, куда свозили бедняков, нищих, париев, 2 мая поступил индус в возрасте 30 лет, подобранный полицией на улице с тротуара без сознания с явными признаками холеры. Утром 3 мая его состояние не изменилось. В образце кала были обнаружены вибрионы холеры почти чистая культура и отсутствие бактериофага, активного к этому вибриону. На другой день, агонизировавший накануне больной, был совершенно здоров. Все симптомы исчезли. Во втором анализе кала, сделанном 3 мая в 6 часов вечера, полностью отсутствовал вибрион и появился бактериофаг, которого не было при первом анализе. Этот бактериофаг был самым активным из множества бактериофагов, выделенных в Индии.

Безусловно, спонтанное выздоровление – это идеальный способ освобождения от инфекционных заболеваний. Но это уже область тонких энергий и для современной науки, не выходящей за пределы биохимии, он пока недостижим.

Из всех проблем современной микробиологии изучение связи бактерии с бактериофагом безусловно является ключевой проблемой.

Уже в 1935 г. Д’Эрелль с убежденностью заявил: «и уже то, что мы знаем о нем (бактериофаге) сегодня, способно повести нас к пересозданию бактериологии, иммунологии, эпидемиологии и терапии». И хотя его интересовали только болезнетворные бактерии, он видел проблему в целом. Следует особенно подчеркнуть его слова “пересоздание бактериологии”. Ведь до сих пор бактерии сами по себе также как и бактериофаги. А если обратиться к промышленной микробиологии, то всюду и везде прослеживается связь бактерий с бактериофагом.
 
Явление спонтанного лизиса производственных микробных культур озадачивает современных микробиологов не меньше, чем в 50-е годы прошлого века. Тогда в начальный период производства антибиотиков эта проблема была очень актуальна, и для ее изучения много сделал Я.Раутенштейн. Основное внимание было уделено подбору условий культивирования, а не поиску какого-то экзогенного бактериофага.
 
На лекции  по микробиологии в университете нам говорили как выглядит сыр высокого качества. Он должен был весь испещрен маленькими дырочками правильной формы с ровными краями. Эти дырочки чем-то напоминали бляшки на агаровых микробных культурах, которые Д’Эрелль называл “стерильными пятнышками”. Через тонкий срез такого сыра можно читать печатный текст. Таким сыром мы могли любоваться в послевоенные годы. Но почему-то потом его не стало не только в магазинах, но и среди описания разных сыров. Да, такой сыр мог быть получен благодаря работе бактериофага, когда после размножения микробов произошел спонтанный лизис.

А сейчас у сыроделов и во всей молочной промышленности бактериофаг объявлен “врагом номер 1”. Пора бы относиться к бактериофагу как к главному преобразователю различных веществ (углеводов, белков, жиров). Если бы заквасочные микробы не были лизогенными (это касается не только стрептококков) молоко так бы и осталось молоком.

В любом случае, когда речь идет о синтезе микробами биологически активных веществ (бактериоцины, антибиотики, токсины, ферменты патогенности, фитотоксины, витамины и другие) не может быть сомнения, что бактериофаг уже побывал в этих микробах и либо остался в них профагом, либо оставил часть своих генов. Еще до конца не изучена и не осознана связь между бактериофагами и микробами. Ведь даже  Д’Эрелль с его гениальным высказыванием о тождестве действия патогенных микробов и бактериофагов сам впал в заблуждение и смог допустить, что взятая им в работу патогенная сальмонелла может быть абсолютно чистой культурой (не содержащей профага), что было доказано вскоре после его кончины. Именно для сальмонелл было отмечено широкое распространение лизогении и указано, что все патогенные бактерии этих видов – лизогенные.

С открытием лизогении (1950 г.) бактериофаги стали делить на вирулентные, вызывающие лизис бактерий и умеренные, способные вызывать и лизис бактерий и сохраняться в них в виде профага. Однако Стент не считал такую классификацию удовлетворительной: “Отсутствие литической реакции, - пишет он, - быть может, укажет только на то, что для него (бактериофага) до сих пор не найден подходящий штамм бактерий или подходящие экспериментальные условия”. Такое же мнение высказывают и современные исследователи: “так как неизвестно, существует ли четкое деление между лизогенными и литическими фагами в природе, и пока недоступны строгие критерии для быстрого и надежного отличия вирулентных фагов от умеренных”.
 
По мнению Д’Эрелля, именно свойства микробной культуры, а не бактериофага, определяют образование вторичных культур. Среди остальных факторов, определяющих образование вторичных культур, Д’Эрелль отмечает температуру, pH среды, длительность контакта бактерий с бактериофагом. Температура от 20 до 30 С является оптимальной для фаголизиса, при температуре в 40 С вторичные культуры образуются во всех пробирках. Оптимальная pH среды для фаголизиса 7,6-8,0, при pH 6,3 бактерии становятся фагорезистентными. Наличие пептона в среде способствует фаголизису, отсутствие пептона ведет к образованию вторичных культур.
 
В естественных природных условиях бактериофаг может длительное время сохраняться в бактериях, особенно если речь идет о споровых формах. Поддержание его в вирулентном состоянии требует периодических пересевов, и чем их больше, тем он активней. “Где есть хозяин, там есть и бактериофаг” – это уже давно азбучная истина. А вот симбиоз бактерия-бактериофаг не стал еще основополагающим понятием в микробиологии. Углубленное исследование этого явления не только откроет новые подходы к лечению, профилактике инфекционных заболеваний и предотвращению эпидемий, но и позволит понять скрытые пока от нас тайны жизненных явлений. И стоит повнимательнее отнестись к высказыванию Д’Эрелля: “Нам кажется, что если изучение электрона, наименьшего возможного количества вещества, приблизило физиков к уяснению сущности материи, то углубленное изучение бактериофага, элементарного существа, поможет бактериологам понять механизм жизни”.

Послесловие
 
Исследование бактериофага особенно на уровне молекулярной генетики кардинально меняет подход к патогенности бактерий. Только те бактерии являются патогенными, в которых бактериофаг либо побывал и оставил в них гены патогенности, либо присутствует в форме профага.

Сейчас, как никогда, является актуальным высказывание Д’Эрелля, сделанное им самим в 1935 г. На сегодняшний день не вызывает сомнения, что самую главную опасность для человека представляет вирус.
 
Бактериофаг может быть использован как модель для исследования вирусов, для поиска новых подходов для лечения вызываемых ими заболеваний. Но главное, он позволил выявить скрытую в самом человеке способность к самоисцелению. Это описанный Д’Эреллем случай с холерой, а также его ранние исследования динамики накопления бактериофага и влияние его на исход болезни.

Уже древнегреческий философ Фалес давал наказ - “Познай себя”, а современный индийский святой Сатья Саи Баба постоянно повторял, что человек, овладев космическим пространством, так и не познал себя. Человек может сам стать своей аптекой, если раскроет свой внутренний потенциал.