Спектральные методы в медицине

Применение спектральных методов в медицине.

Николай Колтовой

Спектральные и фотометрические методы уже давно применяются в лабораторной диагностике. Огромные возможности этих методов уже ни у кого не вызывают сомнений.  В настоящее время появилась возможность применить спектральные и фотометрические методы в микроскопии. Основная задача, которой посвящена данная работа – повышение качества диагностики, постепенные переход от субъективных и качественных методов диагностики к объективным и количественным методам диагностики.
Человеческий глаз – уникальный оптический прибор, но для оценки состояния клеток на препаратах он обладает рядом существенных недостатков:
1-глаз формирует качественную оценку (приборы дают количественную оценку)
2-низкая чувствительность к изменению оптической плотности объекта
3-объекты с разным спектром излучения воспринимаются как имеющие одинаковый цвет
4-узкий спектральный диапазон чувствительности
Микроскоп, как оптический прибор, формирует информацию о клетке в спектральном диапазоне от 200 до 1100 мкм. Человеческий глаз, как оптический прибор, регистрирует информацию в спектральном диапазоне от 400 до 700 мкм. Таким образом, получается, что микроскоп дает информацию, а человеческий глаз ее не видит.
Возникает вопрос – можно ли создать комплекс, который позволит получать количественную информацию о клетке в более широком спектральном диапазоне и с более высокой чувствительностью. И затем использовать эту дополнительную информацию для повышения качества диагностики.
Решением данного вопроса является комплекс, состоящий из микроскопа состыкованного со спектрофотометром. В этом случае приемником информации является не человеческий глаз, а спектрофотометр. Спектрофотометр дает количественную информацию о спектральных свойствах клетки, регистрирует более широкий спектральный диапазон излучения, обладает более высокой чувствительностью.
Исследовательский комплекс состоит из микроскопа и компактного USB спектрофотометра. В принципе, для исследований можно использовать различные типы микроскопов и спектрофотометров.
Можно использовать любой спектрофотометр, у которого имеется оптоволоконный вход. Для микроскопа основным требованием является наличие тринокуляра (порт для подключения цифровой камеры), так как стыковка микроскопа со спектрофотометром осуществляется через тринокуляр. На самом деле, можно осуществить стыковку спектрофотометра с микроскопом и при отсутствии тринокуляра. В этом случае спектрофотометр стыкуется с микроскопом через переходник в один из окуляров.
При использовании микроскопов проходящего света можно регистрировать спектры поглощения клеток, зафиксированных на предметных стеклах. При использовании флуоресцентного микроскопа можно регистрировать спектры флуоресценции клеток. При использовании инвертированного микроскопа можно регистрировать спектры поглощения живых клеток в чашке Петри. При использовании стереомикроскопа можно регистрировать спектры отражения микрообъектов.
Стыковка микроскопа со спектрофотометром осуществляется с помощью оптического кабеля. Один конец оптического кабеля устанавливается на оптической оси микроскопа, а второй конец оптического кабеля подается на вход спектрофотометра.
Стыковка оптического кабеля с микроскопом осуществляется с помощью специального адаптера. С одной стороны адаптер имеет резьбу для соединения с тринокуляром микроскопа. С другой стороны адаптер имеет специальную оптическую резьбу для соединения с разъемом на оптическом кабеле. С помощью специального центрирующего приспособления можно точно отцентрировать положение оптического кабеля – чтобы он находился точно на оптической оси. Таким образом, оптический кабель устанавливается вместо цифровой камеры, и положение торца оптического кабеля юстируется таким образом, чтобы он находился на месте чувствительной матрицы цифровой камеры. Торец оптоволокна является чувствительным элементом, регистрирующим излучение.
Оценим размер области на препарате, с которой регистрируется спектр. Пусть используется объектив 10х. Это означает, сто увеличение микроскопа 10х. Если используется оптоволокно диаметром 200 мкм, значит при обратной проекции торца оптоволокна на предметную область получим пятно размером 20 мкм. Таким образом имеем следующее соответствие увеличения объектива и размера спектрофотометрируемой область: 4х – 50 мкм, 10х – 20 мкм, 20х- 10 мкм, 40х- 5 мкм, 100х – 2 мкм. При использовании оптоволокна большего или меньшего диаметра будем получать соответственно большее или меньшее значение размера области. Но необходимо отметить следующее – при уменьшении диаметра оптоволокна в два раза, в четыре раза уменьшится площадь торца, и соответственно в 4 раза уменьшится регистрируемый световой поток. Таким образом, минимальный размер регистрируемой области ограничивается чувствительностью спектрофотометра. Так же необходимо помнить, что при работе со слабыми световыми потоками резко возрастают шумы. Оптимальным диаметром оптоволокна можно считать 200 мкм.
Можно плавно менять размер регистрируемой области без смены объектива и оптоволокна. Для этого достаточно перемещать торец оптоволокна относительно отъюстированного положения. Таким образом, размер регистрируемой области может непрерывно изменяться от 2 мкм до 100мкм.
При использовании стереомикроскопа, у которого имеется плавное изменение увеличения, размер регистрируемой области можно менять ориентировочно от 0,1 до 10 мм. Более точно границы рассчитываются на основе оптических характеристик конкретной модели микроскопа.
Изменяя размер регистрируемой области, можно получить обобщенный спектр целой группы клеток, или одной клетки. Для какой то отдельной клетки можно зарегистрировать спектр поглощения для ядра и для цитоплазмы отдельно.
Необходимо отметить, что не обязательно размер регистрируемой области должен соответствовать размеру изучаемого объекта. Размер регистрируемой области должен быть больше или равен размеру изучаемого объекта.
Допустим, что необходимо зарегистрировать спектр флуоресценции очень маленькой, и очень яркой частицы. Для этого нет необходимости использовать сверхтонкое оптоволокно. Для этого достаточно зарегистрировать спектр  некоторого места на препарате, где нет частицы. Использовать этот спектр как эталонный, и вычесть его из спектра препарата где имеется частица. Результирующий спектр и будет являться спектром исследуемой частицы. При таком методе можно работать с оптоволокном большого диаметра и высокой чувствительности.
Работа на данном комплексе осуществляется очень просто. Клетку, спектральные свойства которой необходимо измерить, устанавливают на оптической оси микроскопа. Для этой цели в окуляре имеется перекрестие, и клетку совмещают с этим перекрестием. Если объект находится на перекрестии – то это означает, что он находится на оптической оси микроскопа. На экране компьютера сразу отображается спектр данной клетки. Дело в том, что спектрофотометр подключен к компьютеру, и в реальном масштабе времени отображает спектр на экране монитора.
При необходимости, полученный спектр можно сохранить и сравнить со спектрами других клеток.

Одним из основных опросов при спектральном анализе является выбор спектрального диапазона для исследований. В зависимости от диапазона длин волн возбуждения и регистрации возможны следующие варианты: УФ (ультрафиолетовое излучение) , видимый свет, ИК (инфракрасное излучение):
200-280 нм -УФ-С (UVC) – коротковолновый УФ,
280-315 нм -УФ-В (UVB) – средневолновый УФ,
315-400 нм -УФ-А (UVA) – длинноволновый УФ,
400-750 нм -Видимый ,
750-1500 нм -ИК-А (коротковолновое ИК излучение) – Ближний ИК,
1500-3000 нм -ИК-Б (средневолновое ИК излучение) – Средний ИК,
3000-15000 нм -ИК-С  (длинноволновое ИК излучение) – Дальний ИК.

Рабочий спектральный диапазон определяется двумя вещами – используемым спектрофотометром и источником излучения. Стандартный диапазон спектрофотометров составляет от 200 нм до 1100 нм. Существуют компактные модели для работы в ближнем ИК диапазоне – от 900 нм до 2500 нм.
Следующим важным шагом является правильный выбор источника излучения. В микроскопе в качестве источника освещения используется галогеновая лампа. Она подходит для регистрации спектров в диапазоне от 400 до 800 нм. При необходимости работы в другом спектральном диапазоне необходимо использовать внешний источник освещения. В качестве внешних источников излучения могут быть:
-УФ - ртутные лампы, ксеноновые лампы, люминесцентные лампы, светодиоды,
-Видимый свет – лампы накаливания, светодиоды,
-ИК – лампы накаливания, светодиоды.
Можно использовать два принципиально различных источника света – источники с широким спектром излучения (например, лампы), и источники с монохроматическим излучением (например, твердотельные лазеры, светодиоды). Источники с широким спектром излучения обычно используются для проведения исследовательских работ. Источники с монохроматическим излучением используются для реализации конкретных методик, отработанных на исследовательском комплексе. Конструкция крепления внешнего источника освещения к микроскопу определяется конструкцией источника и конструкцией микроскопа.

В зависимости от метода освещения и регистрации возможны следующие варианты
-работа в отраженном свете (регистрация спектра отражения),
-работа в проходящем свете (регистрация спектра поглощения),
-Люминесцентный анализ (регистрация спектра флуоресценции),
Таким образом, возможны следующие варианты:
1-отражение УФ, 2-отражение видимое, 3-отражение ИК,
4-поглощение УФ, 5-поглощение видимое, 6-поглощение ИК,
7-люминесценция в видимой области при возбуждении УФ излучения,
8-люминесценция в ИК области при возбуждении видимым излучением,
9-возможны случая свечения в ИК области при возбуждении УФ излучением,
10-регистрация собственного излучения объектов.

Методика работы на микроскопе-спектрофотометре.
-На микроскоп устанавливают препарат выбирают необходимое увеличение и поле зрения.
-Затем препарат выводят на чистое поле зрения (чистое стекло, где нет клеток).
-Переводят микроскоп в режим работы тринокуляра. Оптический поток переключают с окуляров на тринокуляр.
-Производят калибровку системы – регистрируется спектр источника излучения.
-Переключают микроскоп на окуляр.
-Передвигают препарат таким образом, чтобы исследуемая клетка оказалась в центре перекрестия окуляра.
-Переключают микроскоп на тринокуляр.
-Регистрируют спектр излучения, прошедшего через клетку.
-Полученный спектра вычитают из эталонного. Получают спектр поглощения клетки.

Спектр поглощения клетки прежде всего определяется составом клетки, теми компонентами, из которых она состоит. Спектр так же несет информацию о состоянии клетки, так как при изменении состояния клетки изменяется ее состав. Степень изменения состояния связана со степенью изменения спектра. Рассмотрим значение различных спектральных диапазонов.
1-УФ диапазон. Известно, что в ультрафиолетовой части спектра содержится информация о белках. Например, типичный белок, не содержащий простетических групп, имеет максимум поглощения при длине волны 280 нм. Нуклеиновые кислоты дают полосу поглощения в районе 260 нм.
2-Видимый диапазон. В видимом диапазоне имеют сильное поглощение различные пигменты и хромофоры:
-меланин – пигмент черного или коричневого цвета,  имеет максимум поглощения в диапазоне 350-700 нм.
-гемоглобин – белок, содержащийся в эритроцитах, переносит кислород. Оксигемоглобин (гемоглобин с присоединенным кислородом – HbO2) имеет максимумы поглощения на длинах волн – 415 нм, 542 нм, 577 нм. Дезоксигемоглобин (гемоглобин без кислорода - Hb) имеем максимумы поглощения на длинах волн 431 нм и 555 нм.
3-ИК диапазон. ИК диапазон является наиболее информативным с точки зрения диагностики различных заболеваний. ИК диапазон содержит информацию о колебательных спектрах молекул. Так как биологические молекулы как правило являются достаточно большими, их колебательные спектры достаточно информативны. Появление пиков поглощения на определенных длинах волн связано с возникновением различных заболеваний.

Возможен режим сканирования. Возможно сконфигурировать систему так, что на одном экране будет отображаться поле зрения с перекрестием, а на другом экране будет отображаться спектр объекта, находящегося на перекрестии. При сканировании препарата путем перемещения столика сразу видно спектр объекта, находящегося на перекрестии. Если при сканировании клеток спектр вдруг изменился – значит, данная клетка отличается от других по своим свойствам.

Важным моментом является выбор алгоритмы обработки полученных спектров. Прежде всего, имеется возможность составлять базу данных по различным объектам (клеткам). Формируются так называемые эталонные спектры для каждого класса объектов. Один из методов формирования эталонного спектра состоит в том, что вводится несколько десятков спектров объектов заданного класса, и полученные спектры усредняются. После того, как сформированы эталоны, можно решать задачу идентификации микрообъектов. Для этого вводится метрика в пространстве спектров, и при предъявлении неизвестного объекта он относится к тому класса, расстояние до спектра которого минимально. Таким образом, имеется возможность осуществлять поиск аналогичных образцов по составленной заранее базе данных эталонных спектров.
Существуют и другие способы интерпретации спектров:
1-Распознавание по одной длине волны. Пусть заранее известно, что некоторое вещество поглощает излучение на определенной длине волны. Необходимо определить, имеется ли в поле зрения это вещество. Для этого достаточно по спектру определить, имеется ли на этой длине волны пик поглощения.
2-Распознавание по двум длинам волн. Измеряется отношение величин поглощения в спектре для двух фиксированных значений длин волн. В зависимости от величины этого отношения принимается решение об отнесении исследуемого объекта к одному из классов. Этот метод применяется при экспертизе твердых жиров. Измеряется коэффициент отражения для следующих длин волн – 410нм и 510нм.
3-Распознавание по трем длинам волн. Из всего спектра выбираются и сравниваются коэффициенты поглощения только для трех длин волн. Для этого спектральные данные отображаются в двухмерном признаковом пространстве. Пространство признаков двухмерно, так как три значения нормируются так, чтобы в сумме давать единицу. Другой вариант состоит в анализе двух отношений: отношения первых двух величин к третьей. Этот метод аналогичен трехкомпонентному представлению цветового зрения. Однако в этом случае в качестве базовых используются не красный (700нм), зеленый (500нм) и синий (400нм) длины волн, а наиболее информативные для распознавания длины волн. Это псевдоцвет. Но полученные данные так же можно отображать в псевдоцветах на экране монитора.
Данный метод применяется для экспертизы мясной продукции. В этом случае измеряется коэффициент поглощения на следующих длинах волн – 545нм, 582нм, 650нм.
4-Распознавание по четырем длинам волн. Если для идентификации объектов не хватает информации, получаемой по трем длинам волн, то производится более тонкий анализ на основе коэффициентов поглощения для четырех длин волн.
Наращивание мощность метода можно проводить и дальше, увеличивая количество анализируемых длин волн.

Одна из важных задача состоит в том, как выбрать наиболее информативные длины волн, по которым происходит распознавание. Для этого существует специальная методика.

Существуют различные математические методы улучшения разрешения спектров. Один из полезных методов обработки спектров с целью выявления перекрывающихся полос называется спектроскопия производных. Метод состоит в вычислении четвертой производной от спектра поглощения.

Рассмотрим различные задачи, решаемые на данном комплексе.

I. Изучение спектров поглощения живых клеток в среде.
Если спектрофотометр подключить к инвертированному микроскопу, то можно проводить анализ спектральных характеристик живых клеток, находящихся в чашках Петри. Особо следует заметить, что при данном способе исследования клетки не подвергаются никакому дополнительному вредному воздействию. Для освещения клеток не используется никакой дополнительный источник освещения, а только галогеновая лампа, как и обычно. При изучении живых клеток регистрируется спектр поглощения излучения, прошедшего через клетку. В спектре поглощения живой клетки содержится информация о состоянии клетки, о процессах происходящих в клетке, о наличии различных веществ к составе клетки.
1-Первая задача состоит в выяснении вопроса – находится ли клетка в нормальном состоянии или нет. По спектру поглощения можно судить о том, что клетка находится в нормальном состоянии или она уже погибает. Такая задача исследовалась на ооцитах человека. Была получена информация о том, что спектры поглощения нормального ооцита и гибнущего ооцита существенно различались. Нужно ли говорить о том, что при наблюдении глазом в микроскоп это были две прозрачные клетки, практически не различимые.
2-Вторая задача при работе с живыми клетками состоит в выяснении вопроса о том, однородна Даная колония клеток, или нет. В реальном масштабе времени идет сканирование калонии клеток на микроскопе и наблюдаются спектры поглощения. Если спектры клеток одинаковы – значит колония клеток однородная. Если имеются клетки с различными спектрами – значит колония клеток неоднородная.
3-Третья задача – типирование клеток. Необходимо определить, какие типы клеток находятся в данной колонии. Для этого на этапе обучения на чистых культурах производится формирование так называемых эталонных спектров для клеток различных типов. Затем при работе с культурой, регистрируют спектр исследуемой клетки и сравнивают его с ранее полученными спектрами. После этого принимается решение – относится ли клетка к одному из ранее изученных типов, или ее относят к нераспознанному типу.
Интересный момент состоит в том, что довольно просто создать ручной сортер клеток. Для этого на инвертированный микроскоп устанавливают два простых микроманипулятора и на них устанавливают двойные держатели с микроинъекторами. Таким сортером возможно производить ручную сортировку клеток на четыре класса. После того, как клетка была идентифицирована и отнесена к одному из четырех классов, ее засасывают в соответствующий капилляр. Таким образом, через некоторое время, в четырех капиллярах сформируются четыре чистые культуры.
4-Четвертая задача – столовые клетки. Задача усложняется тем, что на начальном этапе не известно, является ли Даная клетка стволовой или нет. В этом случае эталонные спектры формируются другим путем.
Для выбранных клеток регистрируют спектры и смотрят как они развиваются. После того как прошел цикл развития, определяют какие клетки были правильными, а какие нет. После этого из спектров правильных клеток формирую эталонный спектр. Таким образом можно сделать вывод, что если клетка, которую мы пускаем в эксперимент имеет правильный спектр, то высока вероятность, что она будет развивать по правильному пути.
5-Количественное определение содержание отдельных компонент в клетке.
Например, заранее известен спектр поглощения гемоглобина. На основании этого можно определить содержание гемоглобина в отдельных эритроцитах (при этом имеется в виду, что эритроциты не окрашены, и работа производится с каплей свежей крови). Так как спектры оксигемоглобина и дезоксигемоглобина различаются, то возможно производить оценку содержания оксигемоглобина и дезоксигемоглобина отдельно.

II. Изучение спектров окрашенных клеток на предметном стекле. 
При оценке степени окраски глазом имеет место быть высокая степень субъективизма, даже если человек не дальтоник. При регистрации степени окраски спектрофотометром мы получаем принципиально более достоверную информацию об окраске клеток. Вполне возможно, что клетки при апоптозе будут прокрашиваться немного по другому, но глаз не замечает этих различий.

III. Определение плоидности клеток. Использование комплекса как фотометра.
С помощью комплекса можно получать количественную информацию о количестве красителя, которое поглотила заданная клетка. Например, если измерять количество красителя, которое поглотило ядро, то это сразу позволяет определять количество хроматина в ядре и определять плоидность клетки. Таким образом, можно выделять диплоидные и полиплоидные клетки. Как известно, наличие полиплоидных клеток является важным параметром для диагностики онкологических заболеваний.
 
IV. Изучение флуоресцентных препаратов.
Если состыковать спектрофотометр с флуоресцентным микроскопом, то возникает ряд новых принципиальных возможностей. При стандартном методе работы с флуоресцентными метками производится возбуждение на одной длине волны и регистрация флуоресценции на другой длине волны. Новый метод состоит в том, что удаляется отсекающий фильтр, и производится регистрация полного спектра флуоресценции. Данный метод позволяет выявлять случаи, когда наряду с основной длиной волны флуоресценции возникает дополнительная флуоресценция на других длинах волн. Так же появляется возможность производить более тонкий анализ флуоресценции при работе не с одним, а с несколькими флуоресцентными зондами.

V. Изучение спектров отражения.
Наряду с изучением спектров поглощения комплекс позволяет производить регистрацию и изучение спектров отражения. В этом случае используется внешний осветитель, который освещает объект сбоку, а отраженный спектр регистрируется через микроскоп. Данный метод применим при оценке биоптатов через микроскоп. Но особенно эффективен данный метод при диагностике заболеваний кожи. Для этого спектрофотометр соединяется со стереомикроскопом. Стереомикроскоп на выносной штанге устанавливается над исследуемым участком кожи человека и при большом увеличении оценивается состояние поверхности и подповерхностных слоев кожи. Анализ спектра позволяет судить о состоянии кровеносной системы. Возможно так же производить диагностику меланомы, так как меланин обладает особыми спектральными свойствами, и возможно производить измерение содержания меланина.
В ботанике очень информативным оказывается изучение спектров отражения от поверхности листа растения. Если имеется некоторое заболевание растения – то спектр отражения изменяется.
Спектр поглощения хлорофилла имеет два максимума – на длине волны 420 нм и 680 нм. Хлорофилл поглощает синий и красный свет. Зеленый свет не поглощается, поэтому листья – зеленые.

VI. Определение содержания билирубина в крови.
Билирубин – оранжево-желтый пигмент, содержится в крови, и имеет максимум в спектре поглощения на длине волны 460 нм. Определение билирубина в крови возможно производить неинвазивно, путем регистрации спектров отражения от кожи. Для повышения точности метода используют регистрацию отражения не на одной, а на двух длинах волн.

VII. Определение содержания белка в плазме крови.
Одним из методов определения содержания белка является прямая спектрофотометрия (метод Вартбурга). Метод основан на способности ароматических аминокислот поглощать свет с длиной волны 280 нм. Интенсивность поглощения пропорциональна количеству белка.
В 1956 году Владимиров Ю.А. и Конев С.В. обнаружили явление флуоресценции белков плазмы крови. Таким образом, содержание белка можно определять и флуоресцентным методом.

VIII. Определение количество кислорода в крови.
Кислород в крови переносится оксигемоглобином. Оксигемоглобин имеет фиксированные пики поглощения на длинах волн – 415 нм, 542 нм, 577 нм. Измеряя интенсивность поглощения на этих длинах волн можно определить количество кислорода в крови.

IX. Спектральный метод позволяет регистрировать ход химической реакции в клетке. При стандартной методике регистрации спектра поглощения сигнал от нескольких молекул достаточно слаб. Новая методика состоит в том, что исследуемый объект (например, цитохром С) соединяется с наночастицами золота размером 20 нм. Под действием света частицы начинают колебаться (плазмотронный эффект). Частоты колебаний соответствуют длинам волн 530-580 нм. В этом случае сигнал на спектре поглощения гораздо более сильный, и можно зарегистрировать сотни и даже десятки молекул.

X. Спектральные методы контроля качества пищевых продуктов.
Спектральные методы очень эффективны для контроля качества продуктов. Наиболее информативны методы флуоресцентного анализа. Рассмотрим для примера несколько случаев.

Мясо. Можно определять тип мяса:
-свежая говядина флуоресцирует темно-красным цветом,
-баранина флуоресцирует темно-коричневым цветом,
-конина флуоресцирует темно-коричневым цветом с ржавым оттенком,
-свинина флуоресцирует розовым цветом с коричневым оттенком,
-телятина флуоресцирует светло-коричневым цветом.
При первых признаках порчи у мяса появляется яркое свечение колоний гнилостных бактерий. При дальнейшем развитии гнилостного процесса, усиливается голубое свечение, спектр флуоресценции сдвигается в коротковолновую область.

Рыба. Свежая рыба флуоресцирует слабым серым цветом. У рыбы, которая начала портиться, наблюдаются пятна в области жабер, плавников и брюшка, которые флуоресцируют желтым, зеленым или голубым цветом.

Молоко. Свежее коровье молоко флуоресцирует интенсивным желтым светом. Если молоко не флуоресцирует – это уже не молоко, а какой-то другой продукт.

Сыр. Несозревший сыр флуоресцирует матово-желтым светом. По мере созревания сыра свечение приобретает голубоватый оттенок. Свечение созревших сыров становится фиолетовым.

Яйца. Свежие куриные яйца, со скорлупой белого цвета, флуоресцируют ярким красным цветом. При длительном хранении спектр флуоресценции смещается в коротковолновую область спектра, и яйца флуоресцируют сине-фиолетовым цветом.

Апельсины. У свежего апельсина вся поверхность флуоресцирует желтым цветом с голубым оттенком. У подмороженного апельсина, или если он начал портиться, флуоресценция становится оранжевой с фиолетовым оттенком. Пораженные грибковой плесенью места светятся сине-голубым светом. Интенсивность флуоресценции пропорциональна степени поражения плода.

Сок. При разведении сока интенсивность полос поглощения понижается. Таким образом можно контролировать степень разведения сока.

Вино. Спектр поглощения вина, изготовленный в определенной местности, имеет характерные особенности. Спектральный метод используют при экспертизе – является ли данное вино – поддельным или нет. Белые вина имеют максимум поглощения в области 280 нм. Красные вина имеют максимум поглощения в области 420 нм и 520 нм. Для идентификации вин используют спектры поглощения в ИК области. Имеются базы данных спектров различных вин. Можно производить идентификацию вин.

Выводы:
Основанием для того, что с помощью спектрального метода можно повысить качество диагностики является следующее:
-количество информации, получаемой спектроанализатором, гораздо больше, чем воспринимает глаз человека,
-спектральная кривая несет в себе гораздо больше информации, чем цвет клетки, воспринимаемый глазом человека,
-спектральные методы изучения клеток применяются уже давно, и их широкое применение в микроскопии сдерживалось только отсутствием необходимых технических средств.

Литература:
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М. Медицина, 1990, 382 с.
2. Бродский В.Я. Трофика клетки. М. 1966.
3. Введение в количественную цитохимию. Пер. с англ. М. 1969.
4. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. Л. Наука, 1977, 294 с.
5. Карнаухов Л.И. Люминесцентный спектральный анализ клетки. М., Наука, 1978.
6. Брумберг Е.М. О флуоресцентных микроскопах. «Журнал общей биологии», 1955, т.16, №3, с.222-237.
7. Законов А.И.  «Абсорбция гемоглобина и некоторых его производных в крайней фиолетовой области спектра». Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук. 1946.
8. Колтовой Н.А. Книга 3. Часть 3-01. Спектральные методы.
Книгу можно скачать с сайта https://koltovoi.nethouse.ru